Komórkowe/molekularne otoferliniskryrytyczne FORAHISHLESITIVEADINDLINEAR ... · Opóźnienie szczytowe odpowiedzi dla p1 (mierzone w milisekundach), amplituda szczytowo-szczytowa dla p1-n1 (mierzona w-[dokument PDF] (2024)

Komórkowe/molekularne

Otoferlin ma kluczowe znaczenie dla wysoce czułej i zależnej od liniu egzocytozy w synapsach komórkowych włosów przedsionkowych

Didier Dulon, 1* Saaid Safieddine, 2* Sherri M. Jones, 3 i Christine Petit2,4

1 Niveriver Victor Segalen Bordeaux 2, Institute of Neurosciences in Bordeaux, Neurofizjology Zespół synapsy słuchowej, inserma, mieszana derecharterch w Health 587, University Hospital Center Hopital Pellegrin, 33076 Bordeaux, France, 2institut Pasteur i Universittis Pierre i Marie Curie, Genetyka i fizjologia i fizjologia Of Hearging, Inmerm Mieszane jednostki badawcze w zdrowiu 587, 75015 Paris, Francja, 3Devartment of Communiciscences and Disorders, East Carolina University, Greenville, Karolina Północna 27858 i 4college de France, 75005 Paryż, Francja

Otoferlin, białko wiążące Ca 2� zawierające w domenie C2, jest wymagane do egzocytozy synaptycznej w słuchowych komórkach włosów.Jednak jego dokładne odczucia zasadniczo nieznane.Intrygująco, nie zaobserwowano wady bilansu u myszy z niedoborem OTOFERLIL (OTOF�/�).Tutaj Weshow, że potencjały czynnościowe złożone nerwu przedsionkowego wywołały podczas przejściowych liniowych ramp przyspieszenia u myszy OTOF�/� Postanowy próg wyświetlacza, niższą amplitudę i zwiększone opóźnienie w porównaniu z myszami typu dzikiego.Korzystając z pomiaru pojemności na złożeniu platformy Inintact Utricles, pokazujemy, że komórki włosów typu I i typu II wykazują niezwykłą funkcję przenoszenia liniowego między wejściem Ca2�, przepływającym przez kanały Ca2� aktywowane przez napięcie i egzocytozę.Tę liniową zależność Ca2� zaobserwowano podczas zmiany prawdopodobieństwa otwartego kanału Ca2� strumień CA2� na kanał podczas różnych potencjałów testowych.W komórkach włosów OTOF/� egzocytoza wykazuje wolniejszą kinetykę, zmniejszoną czułość CA2� i nieliniową zależność Ca2�, pomimo normalnych synapsów morfologicznych i normalnych prądów CA2�.Dochodzimy do wniosku, że Otoferlin jest niezbędny dla funkcji czujnika Ca2� o wysokim powinowactwie, która umożliwia wydajne i liniowe kodowanie bodźców o niskiej intensywności w synapsie komórek włosów przedsionkowym.

Wprowadzenie w ślimakowych komórkach włosów, transmisja synaptyczna obejmuje wysoce koordynowany proces uwalniania wielopłaszczyznowego, który jest wyzwalany przez jony BYCA 2� przepływające przez pobliskie klastrowane Ca 2� Chan-Nels zawierający CAV1.3 (�1D) (Glowatzki i Fuchs, 2002, 2002; Brandt i in., 2005).Co ciekawe, liniowa zależność między komórką włosów prąd CA 2� a pęcherzykiem synaptycznym (Johnson i in., 2005; Schnee i in., 2005; Beurg i in., 2008).Również funkcja transferu synaptycznego związana z prądem presynapticca 2� i postsynaptyczna aktywność aferentna działa w bardzo wydajnym schemacie liniowym (Keen i Hudspeth, 2006; Goutmanand Glowatzki, 2007).Ta liniowa funkcja transferu synaptycznego INFORMACJE Sensoryczne z małych stopniowych potencjałów receptorów będą przenoszone z minimalnym zniekształceniem przez synaps, jako infotoreceptory (Thoreson, 2007).

Sugerowano, że Otoferlin, duże transbłonowe białko wiążące Ca 2� z sześcioma domenami C2, działa jak

Główny czujnik CA 2� dla uwalniania neuroprzekaźników w synapsach wstążki komórkowej słuchowej (Yasunaga i in., 1999; Roux i in., 2006).Wynik niepowodzenia egzocytozy wywołanej przez Ca 2� w współwrzewnych komórkach włosów (Roux i in., 2006; Beurg i in., 2008).Otoferlinlokalizuje się do pęcherzyków związanych ze wstążką i oddziałuje w sposób zależny od CA 2�, z syntaksyny-1-teinsin-1 i Snap25 z kompleksem SNAre (receptor SNAP) in vitro.Ponadto domena C2D Otoferlincan wiąże się z podjednostką Cav1.3 kanału wapniowego in vitro (Ramakrishnan i in., 2009).

Jednak nie badano jednak egzocytozy pęcherzyków synaptycznych w komórkach włosów przedsionkowych ssaków.Podobnie jak komórek włosów ślimakowych, komórki włosów rozsiane wyrażają kanały Ca 2� typu L zawierające podjednostkę THECAV1.3 (Bao i in., 2003; Dou i in., 2004) i Otoferlin (Yasunaga i in., 1999; Roux it.Al., 2006;Tej białka może zatem działać jako czujnik CA 2� dla neurotransmitterrelelase również w komórkach włosów przedsionkowych.Pomimo faktu, że otof�/�

Myszy nie mają pozornej dysfunkcji przedsionkowej w zachowaniach rażących (Roux i in., 2006; Schwander i in., 2007), mogły zostać przeoczone subtelne synapsy komórek włosów atwestibularnych.

Ssaki przedsionkowe narządy sensoryczne są na ogół odpisane jako analizy o niskiej częstotliwości ruchu głowy od fewherz do pozycji stacjonarnej (pochylenie głowy), ale synapsy komórek przedsionkowych działają z precyzją czasową w zakresie Milliisec-Eond.W szczególności opóźnienie wystąpienia ruchu głowy do rozpoczęcia ruchu oka w odruchu przedsionkowym jest poniżej 10 ms (Huterer i Cullen, 2002).Włókna nerwowe przedsionkowe wykazują ponownie wymyślony związek liniowy między potencjałem czynnościowym

Otrzymał 1 marca 2009 r.;Zmieniony 7 lipca 2009 r.;Zaakceptowane 8 lipca 2009 r. Prace te zostały wsparte przez National Institutes of Health Grant ROI DCOD6443 (S.M.J.), Komisja Europejska

Zintegrowany projekt FP6 EuroHear Grant LSHG-CT-2004-512063 (C.P.), Agence Nationale de la Recherche Grant ANR-07-Neuro-036-01 (S.S.) i Fondation Voir et Entender (D.D.).Dziękujemy Emilie Hoang Dinh, Yohan Bouleau, Bruce Mock i Isabelle Roux za pomoc w niektórych eksperymentach, Tim Jones i Maryline Beurg Forhelpful Dyskusja oraz Jean-Pierre Hardelin za krytyczną lekturę tego manuskryptu.Dziękujemy Pierre Costet za podniesienie kolonii myszy na Uniwersytecie Bordeaux 2.

*D.D.i S.S. w równym stopniu przyczynił się do tej pracy. KOREPTYCJA powinna być skierowana do Didiera Dulona, ​​Universite Victor Segalen Bordeaux 2, Institut des Neuro-

Nauki Bordeaux, zespół neurofizjologii synapsy słuchowej, inserma, mieszana jednostka badań w zdrowiu587, University Hospital Center Hopital Pellegrin, 33076 Bordeaux, Francja.E-mail:[e -mail.].

Doi: 10.1523/jneurosci.1009-09.2009Copyright © 2009 Society for Neuroscience 0270-6474/09/2910474-14 15,00 $/0

10474 • Journal of Neuroscience, 26 sierpnia 2009 r. • 29 (34): 10474 –10487

Szybkość ładowania i prędkość obrotu głowy (Goldberg andfernandez, 1971; Hullar i Minor, 1999).Te charakterystyki liniowości i precyzji czasowej, które są podobne do tych, którzy znaleźli słuchowe komórki włosów, skłoniły nas do scharakteryzowania Ca 2� de-pendencji i kinetyki egzocytozy synaptycznej w mysich komórkach przedsionkowych i zbadania możliwej roli otoferlin w tych propertach.

Materiały i metody Gravity Funkcja receptora: Potencjały wywołane przedsionkiem Zastosowanie myszy zostało zatwierdzone przez Komitet Użytkowania Zwierzęta Instytucjonalnego na Uniwersytecie East Carolina.Myszy znieczulono dootrzewnowe zastrzyki ketaminy (75 mg/kg) i ksylazyny (8 mg/kg).Temperaturę ciała rdzeniowego utrzymywano przy 37,0 � 0,2 °, co stanowi homeotermiczny system kocowy ogrzewania (FHC Inc.).

Nagrania potencjału wywołanego przedsionkiem (VSEP) oparto na met-modach opublikowanych przez Jones i in.(1999, 2006).Metody te zostały zmodyfikowane do obecnego badania w celu zastosowania nieinwazyjnego systemu sprzęgania do zabezpieczenia głowy do mechanicznej wytrząsarki.Bodźce dostarczono do głowy do sterowanego napięcia mechanicznego wytrząsarki.Głowa była połączona z platformą Edustom z niestandardowym klipsem głowy.Klips był lekkim sprężynowym sprężynowym klipsem do włosów z zębami zmodyfikowanymi w celu otaczania przedniej głowicy pinnae.Klips sprężyn został przykręcony do niestandardowej platformy zamontowanej do mechanicznej wytrząsarki.Drut ze stali nierdzewnej umieszczono podskórnie grzebień karki, aby służył jako nieodwracająca elektroda.Zatoki elekowe igły umieszczono odpowiednio z tyłu na prawej pinnie i pod brzuszną szyję i elektrody uziemiające.Tradycyjne średnio sadzenie sygnału zastosowano do rozwiązania odpowiedzi w zapisach elektrofizjologicznych.Trwająca aktywność elektroencefalograficzna została wzmocniona (200 000 �), filtrowano (300–3000 Hz, punkty amplitudy �6 dB) i zdigitalizowane (1024 punkty, 10 �s/punkt).W sumie 256 pierwotnych odpowiedzi uśredniono kształt fali odpowiedzi VSEP.Wszystkie odpowiedzi zostały powtórzone.

Liniowe impulsy przyspieszenia, czas trwania 2 ms, przedstawiono CRA-Nium w osi Naso-Occipital przy użyciu dwóch polaryzacji bodźców, normalnej i nieinwertowanej.Bodźce przedstawiono z prędkością 17 impulsów/s.Ampli-bodźce bodźca wahało się od �6 do 18 dB, Re: 1,0 g/ms (gdzie 1 g � 9,8 m/s 2) dostosowane do 3 dB.Broadband do przodu (50–50 000 Hz, poziom ciśnienia dźwięku 97dB) został przedstawiony podczas pomiarów VSEP, aby nieobecności odpowiedzi ślimakowych.Nagrania rozpoczęły się od intensywności bodźca Maxi-Mum (tj. �6 dB, RE: 1,0 g/ms) z maskowaniem i bez procusu, a następnie zrzucono intensywność do �18 dB i wcale w 3 dB, aby uzupełnić profil intensywności.Oceniono pierwsze trzypozytywne i negatywne piki odpowiedzi.Pierwszy pik odpowiedzi (tj. P1 i N1) zastosowano do analiz, ponieważ ten pik reprezentuje aktywność nerwową nerwową z obwodowego nerwu przedsionkowego (Nazareth andjones, 1998).Opóźnienie szczytowe odpowiedzi dla p1 (mierzone w milisekundach), amplituda piku do szczytu dla p1-n1 (mierzona w mikrowoltach) i prognosty (mierzone w decybelach, Re: 1,0 g/ms) zostały określone ilościowo.Liniowo wykorzystano w celu uzyskania opóźnienia i intensywności i amplitudy-w stokach z rozmiary dla każdego zwierzęcia na nieważonych surowych danych.Dla każdego genotypu wygenerowano deskryptatyzm.Zmienność jest zgłaszana ASSD, chyba że zaznaczono inaczej.Test t niezależnego próbek zastosowano do opóźnienia P1, amplitudy P1 - N1, progi VSEP i slopesbet między genotypami.

Myszy uzyskano przez krzyżowanie myszy OTOF�/� Heterozygotem Genotypowanie DNA pod względem PCR (tkanka RedExtract-N-Amp PcrKIT; Sigma) przy użyciu starterów 5�-CacttGCTTTGTCTCATCTCC-3� i 5�-GTCACTTCTTCTGGGTTTTTC-3�.Poniższy produkt PCR wygenerował: pojedynczy produkt 1,23 kBP dla myszy typu dzikiego (OTOF�/�), pojedynczy produkt 507 bp dla myszy z nokautem hom*ozygoty (OTOF�/�) oraz produktów PCR dla myszy OTOF�/�(Roux i in., 2006).VSEPS uległy 2-miesięcznym OTOF�/�, OTOF�/� i OTOF�/� myszy (odpowiednio N � 5, N �11 i N � 9).Nie stwierdzono istotnych różnic (opóźnienie starych) między myszami OTOF�/� i OTOF�/� (danych nie pokazano).

Nagrania z mysiego przedsionkowego preparatu Utricleorgan.Badanie egzocytozy przeprowadzono na 36 myszy (12 OTOF�/�, 8 OTOF�/� i 16 OTOF�/�), w wieku 4 (P4) do P9 do P9

Wydane z 12 różnych miotów.Nagrania aktywności strzelania na zakończeniach typu ICACYX przeprowadzono na łącznie 14 myszy P17 - P30 wydanych z różnych miotów (dziewięć OTOF�/� i pięć OTOF�/�).Noworodkowe micere były uzyskane przez krzyżowanie myszy heterozygotów otof�/�.Rekordy i analiza przeprowadzono przed poznaniem genotypu myszy.Allexsperiments przeprowadzono zgodnie z wytycznymi dotyczącymi ubezpieczenia podsmowego i pasteurowego.Uważano, aby zminimalizować ból zwierząt. Młoga głęboko znieczulono w razie potrzeby, z mieszaniną gryzoni [ketaminy przy 50 mg/kg (Panpharma) i Rompun przy 5 mg/kg (Bayerpharma)].

Eksperymenty przeprowadzono na świeżo wyciętych narządach Utricular, które otoconia zostały starannie usunięte z górnej powierzchni nabłonka czuciowego po lekkim trawieniu enzymatycznym z proteinasexxiv (50 �g/ml przez 5 minut; Sigma).Ekstrakcja z kasy skroniowej i etap wycięcia Utricle przeprowadzono w zimnym (5–10 ° C) roztworu podobnym do perilymph [w mm: 135 NaCl, 5,8 kcl, 1,3 CACL2,0,9 mgcl2, 0,7 NaH2PO4, 5,6 d-glukoza, 2 Na-i-pirogronian i 10 Na-Hepes, pH 7,4 (osmolalność w pobliżu 300 mmol/kg)].Wyróżniony sensoryorgan został następnie ustalony na płasko, z wiązkami sterocilii skierowanymi w górę, pod annetami nici dentystycznych zakotwiczonych na dnie komory perfuzyjnej eksperymenu (komora PC-H z Siskiyou).RecordingCamber wypełniono 2 ml perilymph [uzupełnionego 1 �M TTX (Sigma), 10 mM tetraetyloamoniowym (herbatą) -Cl i 100 nm apaminą (latoksan);Podczas nagrań ICA i �CM], a organ był ciągle perfundowany w temperaturze pokojowej (22–24 ° C) z prędkością 100 � l/minus pompy Masterflex LS (Cole Parmer Instrument Company).Tesensoryczne komórki włosów oglądano za pomocą 40� LWD-immersionobjective (apertura numeryczna 0,8) na mikroskopie Olympus BX51WI.

Elektrofizjologia.Nagrania pełnokomórkowe z pękniętą cząsteczki zostały wykorzystywane przy użyciu elektrod 3–4 M� pobieranych z naczyń włosowatych szklanych borokrzemowych (1B150F-4; WPI) na mikroelektropullerze SACHS (Model PC-84; Sutter).Czubek pipet nagrania plasterów został dobrze wypolerowany z mikroforge (MF-830; Narishige) w celu poprawy stabilności odp*rności na uszczelnienie i pokrytych woskiem narciarskim (SWIX) w celu zminimalizowania pipettecapacytancji.Wewnętrzne roztwór pipety zawierało następujące (INMM): 150 CSCL, 1 mgcl2, 5 Tea-Cl, 1 EGTA, 5 Na2ATP, 0,5 Na2GTP i 5-podawania 5 CS, pH 7,4 (osmolalność blisko 300 mmol/kg).Spotwierdził cieczy 2 mV (nie skorygowany w naszych zapisach) mierzono między wewnętrznym roztworem pipety a roztworem zewnętrznym.

Zmiany w czasie rzeczywistym w pojemności membranowej (�CM) zostały dokonane przy użyciu obwodu „Track-In” wzmacniacza optopatch (CAIRN Research), które wcześniej opisano przez Johnsona i in.(2002).Fala sinusoidalna 2,5 kHz wynosząca 18–20 mV zastosowano do komórek z potencjału trzymania �80 mV. Wyjście wzmacniacza prądu błony, pojemności błony i op*rności na serie zostały uzyskane i przeanalizowane za pomocą oprogramowania Digidata 1320A i PCLAMP 10 i PCLAMP 10(Urządzenia molekularne).Sygnały CM Werelow-Pass filtrowano przy 80 Hz.Odpowiedzi � cm mierzono 50 ms po impulsie depolaryzującym i uśredniono w okresie 100–300 ms.

Komórki włosów typu I i typu II zostały zasadniczo zarejestrowane z środkowej części Utricle w pobliżu strefy Striola.Właściwości membrany pasywne i odp*rność na dostęp do komórek włosów oceniono za pomocą funkcji błony w Clampex (PCLAMP 10).Nie zaobserwowano istotnych różnic w op*rności na CM i Serie (RS) między typem dzikim [RS �11,46 � 1,25 M� z CM � 4,11 � 0,13 pf (N � 45);Typ II: Rs � 11,22m� � 1,27 z CM � 3,91 � 0,14 PF (N � 16)] i OTOF�/� [Typ I: Rs � 11,07 � 0,60 M� z CM � 4,24 � 0,24 pf (N � 23 23);Typ II: Rs �11.23 � 0,81 M� z CM � 4,29 � 0,16 PF (N � 19)] komórki włosów.Fryzury, które nie przedstawiły stabilnych RS podczas eksperymentalnych nagrań, odrzucono.

W celu zapisu spontanicznej aktywności strzelania postsynaptycznego (działanie działań), luźne nagrywania łatek (RSEAL � 15–100 m�) z fali komórek typu I przeprowadzono w normalnym 1,3 mm Ca 2� Perilymphby przy użyciu elektrod 5–6 m�wyciągnięte z podobnych szklanych naczyń włosowatych.THEAMPLIFIFIER został ustawiony w trybie prądu lub napięcia i utrzymywano przy zerowym potencjale prądu, bez wtrysku prądu, z niskim filtrem przełowym przy 10 kHz.W przypadku spontanicznych zapisów EPSCS przyciągnięte komórką szczelne uszczelki (RseAl � 4,4 � 0,6 g�) przeprowadzono na zacisku podwodnego w fryzurze typu I przy �80 mV w obecności 1 �M TTX.Zastosowaliśmy program Minianalays 6.03 (Synaptosoft) do wykrywania i analizy pików

Dulon i in.• Otoferlin i egzocytoza w komórkach włosów przedsionkowych J. Neurosci., 26 sierpnia 2009 r. • 29 (34): 10474 –10487 • 10475

Spontaniczne miniaturowe prądy synaptyczne.Zdarzenia szczytowe wykryto AU-tomatycznie za pomocą progu amplitudy, dwa razy większy niż średni hałas kwadratowy korzeniowej (5 PA).Należy zauważyć, że nasze ustawienia analizy programu, tj. Próg i okresu przeszukiwania (5 ms), spowodowały leczenie większości zdarzeń wielofazowych jako pojedynczych pików.Aby zablokować aktywność sponową, preparat perfundowano 50 �M NBQX przez co najmniej 10–15 min (Tocris Bioscience).

Identyfikacja komórek włosów typu I i typu II.W ramach różnicowej kontrastmikroskopii, skupiając się w górę i w dół na przygotowanie, fryzury typu I zostały rozpoznane z otaczającymi pojedynczą lub wieloma kalicesami.Fur-Thermore, komórki włosów typu I można również zidentyfikować na podstawie komórek włosów typu II bez zapisów elektrofizjologicznych poprzez ekspresję GKL, specyficzną kondycję częściowo przepuszczalną dla jonów CS � i aktywowane w pobliżu spoczynku (Rusch i in., 1998; Bao i in., 2003).Komórki włosów przedstawiające Aslowly aktywujące zewnętrzne przewodność CS � przy pozytywnych potencjałach, które są podważane jako typu I, podczas gdy inne komórki zostały uznane za typu II. Chociaż nasze zapisy zostały zasadniczo wykonane w obszarze Striola w The Uutricle, w którym występuje szybsze dojrzewanie, jest to możliwe, jest to możliweTo, że niektóre komórki włosów nazywane typem II mogą odpowiadać niezróżnicowanym komórek typu IHAIR, które nie wyrażają jeszcze GKL i mają niepełne zaniepokojenie ATP4 –P9 (Rusch i in., 1998).W naszych warunkach eksperymentalnych, przy użyciu anintracomórkowego roztworu rejestrującego zawierającego 150 mM CSCL, czas aktywacji i amplituda GKL była wystarczająco niska, aby umożliwić rejestrację prądów Ca 2� aktywowanych na napięcie (ICA) w komórkach włosów typu I.

Analiza dopasowania krzywej i analiza statystyczna.Dopasowanie krzywej i analiza statystyczna wykonano za pomocą oprogramowania Origin (OriginLab) i GraphPad Soft-Ware.Kryterium istotności statystycznej wybrano jako P 0,05 i ocenione za pomocą testów F i testu t Studenta lub dwukierunkowej ANOVA.WARALIZACJA jest zgłaszana jako �Sem, chyba że zaznaczono inaczej.Ponieważ rekordy z OTOF�/� i OTOF�/� Komórki włosów przedsionkowe nie wykazały znaczącej różnicy w ICA i �CM, dane te zostały połączone w tej samej grupie, określane jako „typ dziki”.

Immunohistofluorescenceinner Preparation i immunohistochemia do światła światła przeprowadzono jak opisano wcześniej (Roux i in., 2006) na 7- i 30-d-stare myszy.Skrawki ucha wewnętrznego (10 �M) przemyto trzy czasy w PBS, wstępnie inkubowano w roztworze PBS uzupełnionym 20% normalnej surowicy koziej przez 1 godzinę, i inkubowano z mieszaniną poliklonalantycznego skierowanego przeciwko Otoferlin (1: 500) i monoklonalnym anty-anty-anty-anty-anty-anty-Przeciwciało �-tubuliny III (1: 200; Sigma) przez noc w 4 ° C.Po trzech myjach PBS skrawki inkubowano przez 1 godzinę z f (AB) �2 fragmentem koziego przeciwciała IgG skoniugowanego z fluoresceiną Alexa488 (między-chim) lub kozim przeciwciałem przeciwdeszczowym IgG sprzężonym z cyjaniną 3 (JacksonImmunoresearch) rozcieńczono 1: 500 w PBS.Następnie sekcja przemyła trzykrotnie w PBS i ostatecznie pokryta jednym kroplą podłożem Offluorsave (BioChem Laboratories).

W przypadku kwantyfikacji wstążki preparaty całkowitego montowania ogniarskiego ustalone z 4% paraformaldehydem (PFA) w PBS permeabilizowano 0,3% Triton X-100 w PBS zawierającym 20% normalnej surowicy koziej surowicy przez 1 godzinę w pokoju pokojowym.Pierwotne przeciwciała przeciwko miozyna VIIA, CTBP2 i GLUR2-GLUR3 zastosowano w rozcieńczeniach 1: 100, 1: 500 i 1: 200, odpowiednio.Mikrofotografie wykonano przy użyciu konfokalnego laserowego skanningmikroskopu LSM510 Meta (Carl Zeiss, Pasteur Institute, Imageople).

Uszy mikroskopowe elektronowe od 6-d-stare myszy utrwalono, jak opisano wcześniej (Roux i in., 2006).Narządy końcowe przedsionkowe były indywidualnie mikrodyssanowane i zostały przetworzone za pomocą techniki progresywnej obniżki temperatury.Ultracienowe skrawki (70 nm) wycięto mikrotomem Leicaultracut i przeniesiono do pojedynczych slotgridów powlekanych formvar.Etykietowanie immunogoldów przeprowadzono jak opisano wcześniej (Roux i in., 2006).Skrawki inkubowano przez noc z przeciwciałami otoferlinorowymi rozcieńczonymi do 1: 200, przemyto, a następnie inkubowano przez 2 godziny z 10 nm skoniugowanymi z złotem kozim przeciwciałami przeciwmysponowymi lub kozłami (1:50; TEBU).Skrawki zabarwiono następnie octanu uranylu i ołowiu i zbadano pod mikroskopem elektronowym JEOL 1200EX.Analizy formorfologiczne, uszy wewnętrzne były perfundowane 4% PFA i 2% glutaraldehydu w PBS, pH 7,4 i zanurzono w roztworze utrwalającym dla

2 godz.Następnie poinformowano je przez noc inkubację w 1% osmettraxidu w 4 ° C, odwodniono w stopniowanych stężeniach acetonu, a EM-kedded w żywicy epoksydowej SPURR w temperaturze 70 ° C.Ultrathinsekcje przeniesiono do powlekanych przez forma siatki pojedynczej rozładowania, zabarwiono octanem uranylu i cytrynian ołowiu, i zbadano pod mikroskopem Jeol 1200Exelectron) (Pasteur Institute, Imageopole).

Funkcja receptora receptora Gravity ma wpływ Funkcja receptora micegrawityzmu z niedoborem inotoferlina, która powstaje z otolitycznych przedsionek, utricle i sakcule, analizowano u 2-miesięcznych mutantów pozbawionych otoferlina (OTOF�/�), poprzez rejestrowanie złożonych działań nerwowych i środkowychPrzekaźniki (VSEPS) Ramki liniowe przyspieszenia (Jones i in., 1999; 2006).Typowe przebiegi VSEP zarejestrowane z OTOF�/� i OTOF�/� myszy na rycinie 1A.Tabela 1 wymienia średnie i SD dla opóźnień i amplitudy pierwszych dwóch pozytywnych pików (N1, N2) (N1, N2).

Pierwszy szczyt odpowiedzi P1 zastosowano do analiz statystycznych, ponieważ jest on wytwarzany przez obwodową część przedsionkowania i miałby na nią wpływ defekt synaptyczny komórki włosów.Przy prezentowanej intensywności bodźca temsimum (�6 dB, Re: 1,0 g/ms) rozkładanie p1 było znacznie dłuższe (P 0,05) (ryc. 1B), P1 - N1AMPLIDE był znacznie mniejszy (p 0,05) (ryc. 1C), a przeprosze były w stanieznacznie wyższe (p 0,05) (Tabela 1) myszy dla myszy OTOF�/�.

Opóźnienie szczytowe odpowiedzi dla P1 zmniejszyło się liniowo wraz ze wzrostem intensywności bodźca (ryc. 1B).Liniowe dopasowanie opóźnienia zmniejszającego się z poszczególnych zwierząt dało podobne nachylenie między OTOF�/�

i myszy OTOF�/� (21,08 � 3,85 vs 21,47 � 4,70 �s/dB, odpowiednio).Jednak opóźnienie P1 było znacznie przedłużone dla Allstimuli testowanych u myszy OTOF�/�, jak pokazano w uśrednionych danych (ryc. 1B).Przedłużone opóźnienia są zgodne z opóźnionym lub zmniejszonym uwalnianiem neuroprzekaźników z komórek włosów.U myszy heterozygoty lub dzikich amplitudy P1-N1-Response wykazywały niemal liniowy związek z intensywnością stim-ulus.Nachylenie amplitudy i intensywności (0,05 � 0,02 �v/dB) jest zgodne z wartościami zgłoszonymi wcześniej u innych gryzoni (Jones i in., 1999; 2006).Natomiast u myszy OTOF�/� funkcja przenoszenia synumptycznego między amplitudami odpowiedzi P1-N1 a amplitudą stymulus była znacznie zmniejszona (0,03 � 0,02 �v/dB; p 0,05).Amplitudy reakcji łączone genotypem zwierząt mogą być dopasowane przez funkcję mocy z N � 1,09 i N � 4.11 dla OTOF�/� i OTOF�/�, odpowiednio (ryc. 1C).

Ogólnie rzecz biorąc, wyniki te sugerują, że niedopuszczalne deficyty funkcjonalne myszy z obwodowymi receptorami grawitacyjnymi.NotA-Blot, poprzednie badanie myszy Deaf5/Deaf5 niosących missensemutitut w OTOF nie zaobserwowało wad VSEP (Longo-guess etal., 2007).Jednak parametry odpowiedzi (opóźnienie i ampli-tude) nie zostały określone ilościowo.Ponadto mutacja missense, która podlega izoleucynie dla asparaginy w domenie C2B białka, może mieć inny fenotyp niż badane tu myszy z nokautem OTOF.

Spontaniczna aktywność synaptyczna nie ma wpływu na fryzury ugniczkowe pozbawione otoferlininy narządów przedsionkowych, dwa rodzaje komórek włosów są opisywane do ich terminali synaptyczny: komórki włosów typu I i typu II (przegląd, patrz Goldberg, 1991; Eatock i in., 2008).Fryzury typu I są otaczane przez pojedyncze zakończenie nerwu z kielicha, a fryzury typu II otrzymują kilka zakończeń boutonowych (patrz ryc. 9).Wzięliśmy zalety dużych końcówek karyłowych otaczających komórek włosów typu I

10476 • J. Neurosci., 26 sierpnia 2009 r. • 29 (34): 10474–10487 Dulon i in.• Otoferlin i egzocytoza w komórkach włosów przedsionkowych

Zbadaj, w konfiguracji plastrowej z przywiązaniem komórkowym, czy wzór spontanicznego uwalniania nadajnika ma wpływ na brak OTOFERLIN.Nagrania przeprowadzono w nienaruszonych produktach myszy p17 - P27 in vitro.U myszy OTOF�/�, spontan-

Rejestrowano aktywność strzelania Oous, z Apatternami kolców (od częstotliwości od 8 do 30 HZIN) podobną do aktywności myszy typu dzikiego (ryc. 2A, B).Rzeczywiście, średnia częstotliwość i uśredniona współczynnik zmienności, wskaźnik regularności strzelania, nie różniły się statystycznie między myszami myszy (OTOF�/�, N � 8) i typu dzikiego (OTOF�/�, N � 13) (ryc. 2C (ryc. 2c,D).Aktywność dopracowania została zablokowana przez antagonistę ampareceptorów NBQX (50 �m; n �3), co wskazuje, że napędzano ją przedsynaptyczne podjednostki glutaminianowe (ryc. Sklejno-jonotropowe glutaminianu, prawdopodobnie zawierające GluR2 i/orglur3..THECONTRIBUTING niekonwencjonalnych mechanizmów synapii (Goldberg, 1996), Suchas Bezpośrednia depolaryzacja przypisywana do akumulacji tokowej � w rozszczepieniu zakończeń nerwów Ca-Lyx, wydaje się zatem limitowane w naszych warunkach in vitro, ale nie można było wykluczyć in vivo.Warto zauważyć, że blok antagowy receptora AMPA przeszedł bardzo powoli i tylko po okresie 10–15 minut perfuzji, niezgłoszony we włóknach aferentnych półkolistych ampullar Crista (Lee i in., 2005),co może odzwierciedlać słaby dostęp do leku do ścisłego rozszczepu synaptycznego w Kaleksie.

Spontaniczne EPSC rejestrowano na zakończeniach kielicha w obecności TTX, który blokuje wyzwalanie potencjału czynnościowego. Nieistotną różnicę w amplitudzie i częstotliwości EPSC stwierdzono pomiędzy myszami typu dzikiego (21–9 pA; n–11) i Otof�/� (22–9 pA; n–12) (ryc. 2E, F). Zarówno jednofazowe, jak i wielofazowe EPSC, które sugerują uwalnianie wielopęcherzykowe (Glowatzki i Fuchs, 2002) zaobserwowano w zakończeniach kielicha typu dzikiego i zmutowanych (ryc. 2G, H). Podobną kinetykę zaobserwowano u myszy zmutowanych i myszy typu dzikiego (średni czas narastania, odpowiednio 0,91–0,17 vs 1,08–0,08 ms; średni zanik stałej czasowej, odpowiednio 4,9–1,8 vs 6,1–1,3 ms;

nie różni się statystycznie przy p � 0,05 w obu przypadkach).Amplitudehistogramy EPSC wykazywały wypaczony rozkład z kilkoma odkrytymi pikami, co sugeruje rozkład wielkierunkowy i możliwość uwolnienia współrzędnych.Proces ponownego wynajmu wielopasmowej z doskonałą koordynacją spowodowałby duże amplitudeePSC.Nie możemy jednak wykluczyć, że zdarzenia wielofazowe i lądowe mogą również wynikać z nakładającej się aktywności Sev-Val Wagons lub Synaps.Pojedyncze duże aferentne błonnik Calix of Type I Hair otrzymuje dane wejściowe z kilku wstążek (miejsca uwalniania) i może być również dimorficzne, tj. Połączone z inną komórką włosów z końcem Kaleksu lub Bouton.Rozkłady amplitudy EPSCS i interwatywne histogramy odstępów odstępów pozostały niezmienione w kielichach OTOF/� (ryc. 2G - J).Dlatego brak Otoferlina nie może wpływać na spontaniczne uwalnianie neuroprzekaźnika i ekspres

Ryc. 1. Potencjały receptora grawitacyjnego wskazują na zmniejszoną synchronizację odpalania neuronów przedsionkowych OTOF/�.Ósme nerwowe potencjały czynnościowe złożone (VSEP) rejestrowano z powierzchni czaszki myszy podczas przejściowych liniowych przyspieszenia.A, reprezentatywne przebiegi VSEP dla jednej myszy OTOF�/� (po lewej) i jednej myszy OTOF�/� (po prawej).Poziomy bodźca są niezależne (Re: 1,0 g/ms) i pokazują serię zmniejszania intensywności od �6 do 18 dB.Dla każdego poziomu bodźca pokazano dwa ślady odtwarzalności.Wartości na lewym końcu każdej pary śladowej reprezentują amplitudę P1 - N1 zmierzoną dla pary. Korzyściowe różnice w amplitudach szczytowych reakcji można zobaczyć między dwoma genotypami.B, C, Reakcja Szczytu opóźnia i próba na różnych poziomach bodźca (oznacza � SEM).Otwarte symbole reprezentują heterozygoty OTOF�/� i wypełnione symboliczne symbusie nokaut hom*ozygote (OTOF�/�).W C funkcje przenoszenia odpowiedzi nerwu przedsionkowego (poziom odpowiedzi odpowiedzi vs bodźca w gramach na milisekundę) zostały wyposażone w następujące funkcje mocy: y � 0,202 � 0,358x 1,09 1,09

(OTOF�/�, R 2 � 0,56) i Y � 0,341 � 0,015x 4,11 (OTOF�/�, R 2 � 0,32).

Tabela 1. Średnie i SD dla progów VSEP i opóźnień szczytowych odpowiedzi i amplitud szczytowych do szczytu przy �6 dB (Re: 1,0 g/ms)

Parametr odpowiedzi heterozygoty (�/�), n � 11 hom*ozygotyczne (�/�) i � 9

Próg (DB, Re: 1,0G/MS) �10,8 � 3,0 �7,5 � 3,7

P1 Opóźnienie (MS) 1,37 � 0,07 1,48 � 0,11n1 Opóźnienie (MS) 1,68 � 0,08 1,79 � 0,12p2 Opóźnienie (MS) 2,13 � 0,10 2,25 � 0,12p1–N1 Amplituda (� V) 0,98 � 0,30 0,60 � 0,22p2 - N2 2Amplituda (�V) 1,05 � 0,43 0,79 � 0,34

Dulon i in.• Otoferlin i egzocytoza w komórkach włosów przedsionkowych J. Neurosci., 26 sierpnia 2009 r. • 29 (34): 10474 –10487 • 10477

Skład funkcjonalnych postsynaptycznych receptorów glutaminianowych w synapsach komórek włosów przedsionkowych.

Egzocytoza zależna od Ca 2� jest zmniejszona w plastycznych komórkach włosów pozbawionych otoferlinfuzji pęcherzyków na mem-brane (egzocytozę) w komórkach włosów nienaruszone narządy Urkularne przez monitorowaniecm w konfiguracji całkowitej klapy za pomocą zamykania się za pomocą blokadywzmacniacz.Wszystkie ex-periments przeprowadzono na UTRICLES z myszy P4–P9, wiek, w którym narządy odwiedzające są funkcjonalne, a fryzury prawie nabyły przewodnictwo bramkowane przez dojrzałe (Rusch i in., 1998).Użyliśmy tutaj myszy P4 –P9, ponieważ w tym wieku można było uzyskać bardziej stabilne grupy pełnoziarniste.Komórki włosów rodentvestibular (Bao i in., 2003; Al-Manza i in., 2003; Dou i in., 2004).Toisolan ICA z innych prądów w eksperymentach o przewagi na fol, dodaliśmy 1 �M TTX, 10 mM herbaty i 100 nm apaminę do roztworu ekstraktakomórkowego i zastosowaliśmy wewnątrzkomórkowy roztwór cezowo-chlorkowy do blokowania większości zewnętrznych prądów potasowych.

Egzocytoza w komórkach włosów typu I wyświetla kinetyka większej i bardziej wydajnej Ca 2�

Zależność niż w komórkach włosów II i komórkach włosów typu II i typu II od typu dzikiego wykazywała szybko aktywujące, nie inaktywujące prądy Ca 2� (ICA) w ponownym momencie depolaryzacji kroków napięcia (ryc. 3, 4).W obu typach komórek analiza bieżącej relacji napięcie, która była określona, ​​że ​​ICA aktywuje się blisko �40 mV i reachowuje maksymalnie blisko �10 mV (ryc. 4d, h).Współpracując do aktywacji ICA, wzrost ACM (�CM) zarejestrowano w 95%testowanych komórek włosów typu dzikiego (N � 45 dla typu I i N � 16 dla komórek włosów typu II), z których amplituda zmierzyłaPoziom kroków i czas trwania, jak pokazano w przypadku komórek włosów ślimakowych (Johnsonet al., 2005; Beurg i in., 2008).Krzywa aktywacji napięcia �CM pokazuje kształt dzwonka, który był zgodny z krzywą aktywowania ICA (ryc. 4C, D), zgodnie z aktywacją „CM, a następnie napływu Ca 2�.

W komórkach włosów typu I depolaryzacja 25 ms od �80 do �10 mV wywołała prąd wewnętrzny (ICA) ze średnią amplitudą 6,6 � 1,4 Pa (n � 8) i jednoczesnym skoku CM średniej 5,5.� 0,6 ff w roztworze pozakomórkowym podobnym do peilymfów zawierającego 1,3 mm Ca 2� (ryc. 3b).Rosnące [Ca 2�] EXT do 5 mm spowodowało, że amplituda ICA o wartości szczytowej 29,0 � 3,1 Pa (N �14) przy �10 mV (ryc. 4d).W tych samych warunkach w 5 mm

[Ca 2�] Ext, komórki włosów typu II miały znaczące większe ICA 58,2 �5,0 PA (N � 9) (ryc. 4E, H).Znormalizowane do ich odpowiednich powierzchni mem-brane (CM), komórek włosów typu I i typu II pokazały A

Maksymalna gęstość prądu CA 2� 7,9 i 14,9 PA/PF, odpowiednio.Odpowiedzi � cm, dla depolaryzacji 500 ms, wyniosły odpowiednio 17,5 � 2,4 i 21,1 � 5,8 FF w komórkach włosów typu I i typu II (ryc. 4C, G).Dlatego wydajność Ca 2� exocy-tosis (�CM/ICA) jest wyższa w komórkach włosów typu I (0,60 ff/PA) niż komórki włosów Intype II (0,36 ff/PA).

Zarówno ICA, jak i �CM zostały zmniejszone przy dodaniu 50 �M piny nifedi (redukcja odpowiednio o 72 � 6 i 93 � 3%; n � 4). Te charakterystyka ICA w komórkach włosów typu I i typu II w dobrym zgodzie w dobrym zgodzie sąz opisanymi w ampullar Crista (Bao i in., 2003; Almanza i in., 2003; Dou i in., 2004).Razem nasze wyniki sugerują, że egzocytoza komórek włosów przedsionkowych jest aktywowana

Ryc. 2. Nagrania postsynaptyczne na zakończeniu synaptycznego kielicha komórek włosów typu I.A - D, Spontaniczne możliwości działania wystrzeliwane u myszy OTOF�/�.Spontaniczną aktywność strzelania zarejestrowano w nienaruszonym mysim Utricle (P17 - P30) umieszczonym w sztucznej pary in vitro w 22 ° C.Typowe nagrywania z OTOF�/� CALYX (A) i OTOF�/� CALYX (B) wykazujące szybkość spontanicznego rozładunku odpowiednio 12 i 14 kolców/s.Perfuzja 50 �M NBQX zablokowała aktywność strzelania (a, po prawej).InterspikeIntervals (ISI; in c) i współczynnik zmienności (CV; SD interwału/średniego interwału skokowego; d) nie różnią się znacząco między kalbami OTOF�/� (N � 13) i OTOF�/� Kalyces (N � 8).E - J, spontaniczne EPSC są normalne u myszy OTOF�/�.Spon-taniczne EPSC rejestrowano w nienaruszonym mysim utricle (P17-P30) umieszczonym w sztucznym peilymie in vitro w obecności 1 �m

TTX.Pokazano typowe nagrania w OTOF �/� CALYX (E) i OTOF�/� CALYX (F).Rozkłady amplitudy EPSC (G, H) i przedziały przedziału (I, J) nie różniły się znacząco.

10478 • J. Neurosci., 26 sierpnia 2009 r. • 29 (34): 10474–10487 Dulon i in.• Otoferlin i egzocytoza w komórkach włosów przedsionkowych

przez napływ Ca 2� przepływa przez aktywowany napięciem Ca 2� typowy

kanały.Prądy CA 2� w przedsionkowych komórkach włosów, podobnie jak w fryzurach ślimakowych, nie wykazują szybkiej inaktywacji czasu (Bao i in., 2003 i obecne badanie).Ta niezwykła cecha kanałów CAV1.3 CA 2� została zależna od regulacji przez białko wiążące Ca 2� podobne do kalmoduliny, CABP4 (Yang i in., 2006; Grant i Fuchs, 2008).Ta nie inaktywująca właściwość Ca 2� Cur-Rent jest z pewnością niezbędna dla stabilności ponownej lewej strony nadajnika podczas ciągłej stymulacji fryzur ślimakowych i przedsionkowych.

Aby scharakteryzować dynamikę rekrutacji puli pęcherzyków, wykorzystaliśmy pojedynczy etap depolaryzowania (od �80 do �10 mV) w czasie trwania od 10 do 3000 ms (w 5 mm pozakomórkowym 2� w celu ułatwienia pomiaru ICA) (ryc. 5).Zależną od czasu CM może być wyposażona w sumę dwóch wykładniczych funkcji z stałymi czasami 30 i 1031 ms odpowiednio w komórkach włosów typu I oraz 170 i 1291 ms w komórkach włosów typu II (ryc. 5).To może odpowiada istnianiu dwóch pul synaptycznych: łatwo wymyślnej puli (RRP), która przypuszczalnie powstaje z pęcherzyków w strefach aktywnych, oraz wtórnej uwalnianej puli (SRP), która reprezentuje uwolnienie pęcherzyków położonych dalej z kanałów 2�.Stosując wartość 37 AF na pęcherzyk (Lenzi i in., 1999), pojedyncze dopasowanie do pierwszej fazy RRP (ryc. 5A, B,

wstawki) dało całkowite zwolnienie 270 i 614Veless z szybkością uwalniania 110 � 8 ff/s (2970 pęcherzyków/s) i 65 � 9 ff/s (1756 pęcherzyków/s) w komórkach typu I i tytułu II.

Aby wykluczyć jakikolwiek znaczący wpływ ofendocytozy na szybkość egzocytozy, oceniono przebieg endocytozy po 500 ms depolaryzacji pulsu od�80 do �10 mV poprzez monitorowanie niższej redukcji CM (ryc. 6 A).Endo-cytoza może być dobrze przybliżona przez funkcję samej eksponistej z średnią stałą czasową 8,6 � 1,3 s (n � 8). Ta stała czasowa endocytozy w komórkach włosów VES-piszczącą jest podobna do wartości ponownie zamienionySłuchowe komórki włosów (Moser i Beutner, 2000; Schnee i in., 2005).Powolna kinetyka endocytozgojemnicza, że ​​niewiele przyczynia się do naszych pomiarów cm dla czasów depolaryzacji impulsów poniżej 3 s.

RRP i SRP na wartości komórki potwierdzone są dwa do czterech razy mniejsze te zgłoszone w innych typach komórkowych włosów (Nouvian i in., 2006).Różnica ta jest prawdopodobnie przypisywana rozmiarowi mysich komórek włosów myszy (ze średnim obszarem błony powierzchniowej odpowiadającej wartości CM 4 FF; wydawanie się i metod) oraz do obecności mniejszej liczby stref synaptycznych.Rzeczywiście, VES-Tibular Hair komórki są około dwukrotnie mniejsze niż wewnętrzne fryzury ślimakowe (średnie CM dla wewnętrznych komórek włosów 8pf) (Moser i Beutner, 2000; Johnson Etal., 2005) i około czterech Timessmaller niż Frog Sackulal Hair komórki włosów (średnia MEDCM of Of of of of of of of of Fon of of of of of Fon of of of Fon of of Fon of of Sackul.15–16 PF) (Edmonds i in., 2004).Jeśli przyjmujemy średnio od siedmiu do dziewięciu żebra

Bons na komórkę włosów przedsionkową (patrz nasze wyniki poniżej) w porównaniu z 15–20 w wierzchołkowych wewnętrznych komórkach włosów (Meyer i in., 2009), wyrównał liczbę pęcherzyków synaptycznych RRP na wstążkę (SV/RIB) 30–38 w typu I w typu IKomórki włosów i 68–88 w komórkach włosów typu II.Infumenty te są porównywalne z zgłoszonymi w mysich komórkach włosów ślimakowych (24–64 SV/RIB) (Johnson i in., 2005; Khimich i in., 2005).

Egzocytoza zależna od Ca 2� jest poważniej dotknięta w komórkach włosów typu I. typu II, które pozbawione otoferlintowanych w podobnych warunkach jak komórki włosów typu dzikiego, komórki włosów allotof�/� typu I (N � 26) wykazały normalną ICA (szczytowa pozytywność,5,4 � 1,9 i 32,5 � 5,8 Pa w 1,3 i 5 mm

[Ca2�]ext), ale bez znaczących odpowiedzi �Cm (poniżej progu tła wynoszącego 0,5 fF) przy depolaryzacji od 80 do 10 mV przez 10 ms do 200 ms (ryc. 3C). Odpowiedź �Cm została znacząco zmniejszona do 1,1 � 0,5 fF (n � 13) podczas depolaryzacji 500 ms przy wartości napięcia odpowiadającej wartości szczytowej ICa

(Ryc. 4b, c).Pierwszy składnik kinetyczny odpowiedzi �cm, odpowiadający RRP, został zniesiony zarówno w warunkach EXT 1,3 mM (ryc. 3C), jak i 5 mm [Ca 2�] (ryc. 5A, wstawka), podczas gdy tą kinetyczną komponent kinetyki egzocytozy egzocytozy, odpowiadający

Rycina 3. Szybka egzocytoza zależna od CA 2� jest upośledzona w komórkach włosów OTOF�/� typu I.Zmiany pojemności membranowej (� cm) zarejestrowano podczas aktywacji napięcia prądu Ca 2� (ICA) w nienaruszonych Utrilach P4 –P9 kąpielowanych w sztucznym perimphu (1,3 mm Ca 2�) in vitro.W A pokazano dwa różnicowe obrazy kontrastowe interferencyjnego nienaruszonego nabłonka Utricle, z którego komórka włosów typu I powinna być zidentyfikowana przez otaczającą kaleks.Większość zarejestrowanych komórek oglądano z ich wierzchołkowej powierzchni, jak pokazano po lewej stronie. Jednak w pobliżu nici trzymającej (czarna linia powyżej po prawej), która utrzymuje i marszczy nabłonek Utricle, fryzury czuciowe można czasem zobaczyć z ich boku ((Prawidłowy).Pasek skali, 10 �m.Krok napięcia 25 ms (od �80 do �20 mV) aktywowany ICA

oraz odpowiedź na cm w komórkach włosów typu I typu I (B).Chociaż podobna stymulacja wytworzyła normalną ICA u myszy OTOF�/�, „CM

Odpowiedź była nieobecna (c).Seria op*rność (RS) została zweryfikowana jako stabilna podczas nagrań.

Dulon i in. • Otoferlin i egzocytoza w przedsionkowych komórkach włosowych J. Neurosci., 26 sierpnia 2009 • 29(34):10474 –10487 • 10479

SRP, utrzymywany, ale ze znaczną dużą stałą czasową 2042 ms (ryc. 5A).

Wadliwą egzocytozę w zmutowanych komórkach włosów typu I nie można przypisać zmianom właściwości CA 2� CUR-CENT.Rzeczywiście, analiza znormalizowanych przewodników-wollagecurvves dała nierozróżnialne parametry Gmax (maksymalna koncern), V1/2 (potencjał dający połowę aktywacji) i S (nachylenie), gdy jest wyposażone w równanie Boltzmanna pierwszego rzędu, w typu dzikim (N � w 5 mm [Ca 2�] EXT;5 mm [Ca 2�] � 1,21 � 0,04 ns;Ponadto, czasy aktywacji ICA były podobne w typu dzikim i OTOF�/�

Komórki włosów (dla etapu od �80 do �10 mV; � � 0,42 � 0,03 i 0,45 � 0,05 ms).Wreszcie, ICA wykazało podobną niską aktywność, ze średnią redukcją o 7,5 � 2,5 i 6,7 � 3,3%w stosunku do stopnia napięcia 500 ms od �80 do �10 mV odpowiednio w komórkach włosów typu dzikiego i MOTOF�/�.

Testowane w podobnych warunkach komórki włosów typu II od Myszy Myszy OTOF�/� wykazywały odpowiedzi ICA (70,3 � 8,1 Pa) i � cm (19,8 � 7,2 ff), które nie różniły się znacząco od komórek włosów typu dzikiego typu II po stawieniu komórek od � �80 do �10 mV dla 500 ms (n � 17) (ryc. 4F - H).Jednak krzywa aktywności CM-V-napięcia u zmutowanych myszy wykazała znaczące niższe odpowiedzi CM dla małych depolaryzacji przy �40 i �30 mV, to znaczy, gdy ICA jest

Rycina 4. Egzocytoza zależna od Ca 2� w komórkach włosów typu I (A-D) i typu II (E-G).Przykład aktywacji napięcia ICA (ślad dolny) wyzwalający jednoczesny skok w membranowej capaci-tance (� cm) w komórce włosów typu I typu dzikiego (a).Komórka utrzymywano przy �80 mV i nadepnęła przez 500 ms do �10 mV.Utricles wykąpano w sztucznym perilymie z 5 mm [Ca 2�] Ext.Stymulowano podobny stan, podczas gdy ICA było zasadniczo niezmienione, komórki włosów OTOF�/� typu I nie odgrywają przede wszystkim zmniejszonej odpowiedzi �cm (B).Krzywa aktywacji napięcia ICA (D) i odpowiadających odpowiedzi �CM (C) w typu dzikim (otwarte czarne koło; N � 14) i OTOF�/� (okrąg wypełniony czerwonym; N � 13) Komórki włosów typu I.Każdy etap napięcia został oddzielony o 1 min, aby umożliwić odzysk.Zwróć uwagę na hamowanie �cm u myszy OTOF�/�, podczas gdy ICA była zasadniczo nienaruszona.Próbka odpowiedzi ICA i �CM w komórce włosów typu dzikiego (E) i OTOF�/� (F) typu II zarejestrowana w podobnych warunkach niż dla komórek włosów typu I.Aktywacja napięcia zakrzywiona ICA (H) i odpowiadającego � cm

(G) W typu dzikim (czarne otwarte koło; N � 9) i w OTOF�/� (Koła wypełnione czerwonymi; N � 17).Należy zauważyć, że CM nie miało znacząco wpływu w komórkach włosów OTOF�/� typu II na szczycie ICA.Jednak przy �40 i �30 mV, w pobliżu progu napięcia aktywacyjnego ICA, �CM były znacznie niższe myszy inmutantów (gwiazdki).Wskazało to na niewielki spadek wydajności egzocytozy Ca 2� w komórkach włosów typuII.

Rycina 5. Kinetyka uwalniania pęcherzyków.A, Egzocytoza komórek włosów typu I (� cm) w odpowiedzi na czas trwania.Komórki włosów stymulowano tym samym etapem napięcia od '80 do �10 mV w sztucznym peilymie zawierającym 5 mm [Ca 2�] ext.Każdy krok został oddzielony o 1 min.Pierwsza faza egzocytozy podczas krótkich bodźców w zakresie od 10 do 200 ms zrekrutowała aninityczny mały składnik, który prawdopodobnie reprezentuje RRP pęcherzyków zadokowanych w strefach aktywnych (INSET).W komórkach włosów typu dzikiego (otwarte czarne kółka; N � 17) dane najlepiej dopasować za pomocą funkcji jednorazowej z � � 34 ms i maksymalnie 9,9 mc.Należy zauważyć, że OTOF�/� Hair Cellsted w podobnych warunkach nie wykazywało znaczących odpowiedzi � cm (wypełnione czerwone koło; N � 19).Komórki włosów typu inwild (otwarte czarne koła; N � 15), zmienność � cm między bodźcami w zakresie od 10 do 3000 ms może być wyposażona w sumę dwóch wykładniczych (�1 � 30 ms i �2 �1031 ms, z a aMaksymalnie cm 37,2 i nast.).W komórkach włosów OTOF/� (wypełnione czerwone kółka; N�14), DataWere wyposażone w pojedynczy wykładniczy (� � 2042 ms).B, w komórkach włosów typu II, w podobnych warunkach doświadczenia, kinetyka � cm w komórkach typu dzikiego (otwarte czarne kółka; N�9) może być również wyposażone w sumę dwóch wykładniczych (�1 � 170 ms i �2)� 1291 ms).W komórkach włosów OTOF�/� typu II (wypełnione czerwone kółka; N � 14) początkowa faza RRP (do 200 ms) była znacznie zmniejszona (wstawka), podczas gdy SRP zasadniczo nie miało wpływu.

10480 • J. Neurosci., 26 sierpnia 2009 r. • 29 (34): 10474–10487 Dulon i in.• Otoferlin i egzocytoza w komórkach włosów przedsionkowych

Małe (ryc. 4G) (p 0,05), co wskazuje, że na proces zależny od Ca 2� jest również dotknięty w komórkach włosów typu II pozbawionych.Szybkość uwalniania składnika RRP ponownej liczby CM została rzeczywiście znacznie zmniejszona do maksymalnej początkowej powiązania 34 � 9 ff/s, co jest wartością około dwa razy niższą niż komórki typu dzikiego (ryc. 5B, wstawka).Natomiast szybkość uwalniania SRP nie miał znacząco dotkniętego (ryc. 5B).Ponownie fryzury typu II pozbawione otoferlina wykazały normalny ICA.Rzeczywiście, znormalizowane krzywe kondycjonowania-napięcie dały nierozróżnialne parametry (Gmax, V1/2 i S; P � 0,05) między typem dzikim (N � 9 komórek; w 5 mm [Ca 2�] ext; Gmax � 2,17 � 0,13 ns; v1; v1; v1; v1; v1; v1; v1; v1; v1; v1/2 � �26,79 � 0,69 mV; s � 6,15 � 0,61 mV) i OTOF�/� (N � 14 Komórki; w 5 mm

[Ca 2�] ext;Gmax � 2,59 � 0,45 ns;V1/2 � 23,49 � 1,88 mV;S �5.25 � 1,62 mV) Komórki po wyposażaniu w Boltzmannequation pierwszego rzędu.Ponadto stałe czasowe aktywacji ICA były odpowiednio w komórkach włosów typu dzikiego i OTof�/� (�10 mV; � � 0,54 � 0,05s i 0,56 � 0,09 ms).Wreszcie ICA

wykazał podobną niską inaktywację, ze zmniejszeniem o 9,1 � 2,3 i 9,9 � 4,0% w kroku 500 ms od �80 do �10 mV odpowiednio komórek typu inwildowego i otof�/�.

Na liniową zależność egzocytozy Ca 2� ma wpływ w komórkach włosów typu I i typu II pozbawionych otoferlinnext, zbadaliśmy związek między wejściem Ca 2� a RRPExocytozą poprzez depolaryzowanie komórek włosów przedsionkowych dla innej trwania, zmieniając [Ca 2�] Ext lub przechodzenie do EXT lub przechodzenie do EXT lub przechodzenie doRóżne testy poadalności.Te różne protokoły zostały zaprojektowane w celu zbadania organizacji miejsc wydania i kanałów CA 2� (CA 2�

domeny) w strefach synaptycznych.Egzocytoza, napędzana przez nanodomeny CA 2� nieeverpping (uważa się, że pojedynczy kanał jest wystarczający do aktywacji uwalniania pobliskiego pęcherzyka), byłaby zmienna, gdy przede wszystkim manipuluje liczbą otwartego chan-nely i nieliniowo, gdy zmienia prąd jednokanałowy jako prąd jednokanałowy jako

W ślimakowych wewnętrznych komórkach włosów (Brandt i in., 2005).Natomiast anorganizacja synaptycznych bezdomów CA 2�, które obejmują nakładające się populacyjne kanały Ca 2�, takie jak zaproponowane w żabach przykładowych komórek włosów (Roberts i in., 1990; Roberts, 1994) przewiduje zmiany w liczbie otwartych kanałówlub w kanale strumieniowym Ca 2� spowodowałoby egzocytozę z podobną liniową de-pendencją na Ca 2� (Augustine i in., 2003).

Zależność liniowa od całki ładowania ICA podczas wpisu cumulativeca2�.Związek między egzocytozą RRP a CA 2�

Wpis został po raz pierwszy oceniany w komórkach włosów typu I i typu II typu II, wykreślając odpowiedź �cm w stosunku do całki ładunku ICA (QCA � ICA �t) podczas stałego etapu depolaryzacji od �80 do �10 mV, w czasie trwania czasu (t) z (t) z10 do 200 ms w 5 mm

[Ca 2�] ext (ICA z komórek opisanych na ryc. 5a).Ten protokół testuje wewnętrzną wrażliwość Ca 2� maszyny synaptycznej niezależnie od odpowiedniego wkładu liczby otwartymi szansy i strumieniem Ca 2� na kanał.Biorąc pod uwagę, że VesicleFusion (�CM) jest proporcjonalny do n -tym mocy miejsc aktywności Ca 2� (Zucker i Fogelson, 1986), dane zostały dopasowane przez równoważenie �cm � g [QCA]

N Z N � 0,72 � 0,02 (współczynnik nachylenia, G �4,56 FF/PC; R 2 � 0,97) i N � 0,90 � 0,02 (G � 1,40 FF/PC; R 2 � 0,99) w komórkach włosów typu I i typu II II włosówodpowiednio, wskazując prawie liniową zależność między skumulowanym wejściem Ca 2� i podekscytozą w obu typach komórek a bardziej wydajnym procesem w komórkach typu IHAIR (ryc. 7A, D).Wartość N 0,72 wskazuje, że przyczepność dopasowania jest nieco „wypukła”, która prawdopodobnie przypisuje się temu, że w pobliżu końcowego zakresu QCA egzocytoza prawie docieka w komórkach włosów typu I (ryc. 5A, wstawka).Nasze wyniki są najważniejsze, że ilość egzocytozy jest liniową funkcją wejścia Ca 2� w strefie aktywnej zarówno w komórkach typu I, jak i typu II.Wniosek ten jest zgodny z modelem Ca 2� „Shelldomina”, w którym rozpowszechnianie jonów Ca 2� i buforów 2� wewnątrzkomórkowych w pobliżu membrany nie jest wolna w miejscu uwalniania, a następnie pozwalając na nasycenie czujnika i liniowy wzrost podekscytozy z depolaryzacjąCzas trwania (Roberts 1994; Kits i in., 1999; Mansvelder and Kits, 2000).

W OTOF�/� UTRICLES, stosując podobny protokół, Exocytoza RRP była całkowicie zniesiona w komórkach włosów typu I (ryc. 5A, 7A, redsymbole) i tylko częściowo zmniejszone w komórkach włosów typu II (ryc. 7D). W OTOF�/�Komórki włosów typu II, dane najlepiej dopasować za pomocą funkcji mocy z N � 1,71 � 0,03 i zmniejszonym współczynnikiem nachylenia G �0,07 � 0,01 ff/pc (ryc. 7D).Co ciekawe, egzocytoza RRP INOTOF�/� Komórki włosów typu I można częściowo uratować podczas wzrostu [Ca 2�] Ext od 5 do 10 mm (ryc. 6A, zielone symbole).DataWere następnie dopasowany za pomocą funkcji zasilania z N � 2,20 � 0,10 i zmniejszonym współczynnikiem nachylenia G � 0,02 � 0,004 FF/PC (ryc. 7A).TeSeReSults sugerują, że albo powinowactwo Ca 2� synaptycznego masy mA jest wyraźnie zmniejszone, albo swobodna dyfuzja jonów Ca 2�, miejsca uwalniania są modyfikowane w taki sposób, że czujnik jest nasycony.

Zależność liniowa od amplitudy ICA podczas zmiany liczby kanałów OPEN i strumienia CA2� na kanał.W celu dalszego zbadania zależności egzocytozy Ca 2� w fryzurach typu I i typu II, niezależnie od czasu trwania bodźca, � cm odpowiedzi były spisane przeciwko amplitudzie szczytowej ICA dla stałego etapu AGE 500 ms przy różnych potencjałach błony, niestabilne 5 mm [Ca 2�] ext (ryc. 7 B, E, F).Aby uniknąć niedoszacowania wejścia Ca 2� (QCA) przez odblokowane na zewnątrz K � Bieżące duże potencjały depolaryzacyjne, egzocytoza była tutaj wykreślona amplituda szczytowa ICA.Dane zostały ponownie zamontowane przy użyciu funkcji Apower �CM � G [ICA]

N, z ICA zmieniającym się przede wszystkim jako funkcja otwartych kanałów Ca 2� (liczba rosnąca wraz z depolaryzacją do maksimum przy �10 mV).Dane były najlepiej dopasowane

Ryc. 6. Kinetyka endocytozy (A) i wrażliwości egzocytozy na wewnętrzne buforowanie Ca 2� (B).A, Przykład endocytozy mierzonej w komórce włosów typu I: wzrost cm (egzocytoza) odpadany przez impuls 500 ms (od �80 do �10 mV w 5 mm [Ca 2�] ext) oraz przebieg czasowy CMZmniejszenie monitorowano w okresie 20 s.Endocytozę najlepiej dopasowaną przy użyciu pojedynczego eksponatu z �� 6,7 s (szarej linii).B, egzocytoza w komórkach włosów typu I rejestrowano w różnych warunkach buforowania Ca 2� Ca 2�: EGTA przy 0,5 mM (N � 15), EGTA przy 5 mm (N � 5) i Bapta przy 5 mm (N � 4).Odpowiedzi � cm wywołano impuls 500 ms (od �80 do �10 mV) w 5 mm [Ca 2�] ext.

Dulon i in.• Otoferlin i egzocytoza w komórkach włosów przedsionkowych J. Neurosci., 26 sierpnia 2009 r. • 29 (34): 10474 –10487 • 10481

Funkcja mocy z N � 0,83 � 0,08 (G � 1,10 � 0,30 ff/PA) i N � 0,85 � 0,08 (G � 0,66 � 0,19 FF/PA) odpowiednio w komórkach włosów typu I i typueII (ryc. 7B, E.), wskazując liniowy związek między wejściem Ca 2� a egzocytozą podczas zwiększania liczby otwartych kanałów Ca 2�.

Związek między ICA i �CM został następnie zbadany przy przede wszystkim manipulowaniu strumieniem Ca 2� na kanał.Al--choć ten związek nie można było zbadać na dodatnich poleganiach w komórkach włosów typu I, ponieważ ICA została zaciemniona powyżej 0 mvby obecność prądu zewnętrznego (prawdopodobne CS� płynne GKL) (Rusch i in., 1998), stwierdzono, że stwierdzonoże �CM i ICA

utrzymywał podobną liniową zależność między �10 i 0 mV. Przy tych potencjałach liczba otwartych kanałów Ca 2� jest con-stant i maksimum;ICA odzwierciedla zatem głównie strumień Ca 2� na chan-nel, który zależy od siły napędowej (ryc. 7b, niebieskie koło).Spotkanie problemu prądu zewnętrznego przy dodatnich potencjalnych tialach, zależności między � cm i Ca 2� na kanał był dalej badany w komórkach włosów typu I przy użyciu różnych [Ca 2�] ext (0, 1,3, 5 i 10mm) przy stałym i maksymalnym woltogeaktywowaniu kanałów Ca 2� (�10 mV) z potencjału trzymania �80 mV, przez 500 ms.Dane zostały ponownie przybliżone do funkcji mocy �cm � g [ICA]

N, z ICA zmieniającym się tylko jako podsekcja strumienia Ca 2� na kanał przy stałej otwartej zdolności kanału.Stosując ten protokół, zależność Exocytozy Ca 2� wykazała ponownie liniową zależność.Rzeczywiście, dane najlepiej udostępniono przy użyciu funkcji zasilania z N � 0,97 � 0,05 i nachyleniem G � 0,95 � 0,20 FF/PA (ryc. 7C).W szczególności podobne relacje liniowe uzyskano przy użyciu krótszych czasów trwania impulsu 50 lub 100 ms (danych nie pokazano).

W komórkach włosów typu II zależność Ca 2� � cm mogłaby zaspokoić pozytywne potencjały bez widocznego zewnętrznego prądu zanieczyszczającego do �20 mV.Podobnie jak w komórkach włosów typu I, �CM wykazywał liniową zależność z ICA zarówno dla małych depolaryzacji (siła dążenia do wejścia Ca 2� jest duża, podczas gdy tylko kilka kanałów otwierało się) (ryc. 7E, czarne kółka) i duże depolaryzacje (liczba otwartych otwartychKanały są maksymalnie powyżej �10 mV, ale strumień 2� na kanał maleje wraz ze wzrostem napięcia) (ryc. 7E, niebieskie kółka).

Razem wyniki te sugerują, że egzocytoza w komórkach włosów typu I i Type II jest proporcjonalna do całkowitego wejścia Ca 2�, niezależnie od liczby otwartych kanałów i strumienia Ca 2� na kanał.Trzeba ta nie jest kompatybilna z organizacją niezależnych nanodomin Ca 2�, zaproponowanych w komórkach wewnętrznych ślimaków, w której zmiana strumienia Ca 2� na kanał jest powiązana z odpowiedzią „CM (Brandt i in., 2005).OurData raczej wskazują sytuację podobną do tej opisanej w żabach przykładowych komórek włosów, w której zasugerowano, że dziesiątki kanałów 2� współpracują w dużej „domenie CA 2�” w każdej syn-apaptycznej strefie aktywnej (Roberts i in.,1990;

Stosując podobny potencjał testowy, gdy zmienia się przede wszystkim liczba otwartych kanałów, punkty danych w mutantowej komórce włosów typu I najlepiej dopasowane przy użyciu funkcji zasilania z N � 3,22 � 0,71 i wyraźnie zmniejszoną wydajnością (ryc. 7B).Podczas zmieniającego się strumienia 2� na kanał w różnych zewnątrzkomórkowych stężeniach Ca 2� (0, 1,3 i 5 mm; 10 i 20 mm) przy stałym napięciu i trwania, komórki włosów OTOF�/� typu I wykazywały również nieliniowe ponowneLaationship między ICA i �CM (N � 3,38 � 0,06) i znacznikiem zmniejszonej wydajności Ca 2� (ryc. 7C).

W zmutowanych komórkach włosów typu II, dla małych depolaryzacji między�80 i �10 mV (rosnące prawdopodobieństwo otwartego kanału) najlepiej dopasowane przy użyciu funkcji mocy z N � 2,10 �20 i znacznie zmniejszoną wydajnością egzocytozy w porównaniu z komórkami typu wiild (komórki typu wiild (Ryc. 7e).Co ciekawe, dla dużych depolaryzacji

Ryc. 7. Funkcja transferu synaptycznego (�CM/ICA) staje się mniej wydajna i nieliniowe inwestycyjne komórki włosów pozbawione otoferlina.A, d, egzocytoza jako funkcja mocy zintegrowanego Ca 2�

Wejście podczas zmieniającego się czasu trwania impulsu (10, 25, 50, 100 i 200 ms) w fryzurach typu I (a) i typu II (d).Dane były dopasowane przez równanie �cm � g [qca] n z n � 0,72 � 0,02 (wydajność nachylenia, g � 4,56 ff/pc) i n � 0,90 � 0,02 (g � 1,40) w typu typu i typu i (a, czarne otwarte kółka;W komórkach włosów OTOF/� dopasowanie danych do nieliniowej funkcji mocy z N � 2,2 � 0,10 (G � 0,02 � 0,004) i N �1,71 � 0,03 (G � 0,07 � 0,01) w typu I (A) i typu II II i typu II(D; odpowiednio wypełnione czerwonymi kółkami; N � 14).W komórkach włosów typu I (a, czerwonej linii) � cm odpowiedzi rejestrowane są w 5 mm

[Ca 2�] ext (czerwone symbole; n � 19) i w 10 mm [ca 2�] ext (zielone symbole; n � 5).B, E, Funkcja synaptyktransferu przy różnych potencjałach testowych w komórkach włosów typu I (B) i typu II (E, F).Odpowiedzi ICA i odpowiadające �CM rejestrowano przy różnych potencjałach błony (etap w wysokości 500 ms od '80 mV w przyrostach 10 mV) w 5 mm [Ca 2�] ext.Linie ciągłe pasują do punktów danych, które oceniają funkcję mocy �cm � g [ICA] n z n � 0,83 � 0,08 (g � 1,10 � 0,30 ff/pA) i n � 0,85 � 0,08 (g � 0,66 � 0,19 ff/pa) W typu typu dzikiego typu I (B, czarne otwarte koła i blokowanie otwartego okręgu przy 0 mV; N � 14) i typu II (E, czarne otwarte koła od �80 do �10 mV i otwarte kółka od 0 do �20 mV;N � 8) odpowiednio komórki włosów.W komórkach włosów OTOF�/� (koła z czerwonymi) dane zostały dopasowane przy użyciu funkcji mocy nieliniowej z N � 3,22 � 0,71 (G �1,48,10 �5 � 0,90,10 �5 FF/PA; N � 13) i N � 13) i N � 13) i N.� 2,10 � 0,20 (G � 0,003 � 0,001 FF/PA; N � 17) odpowiednio w komórkach włosów typu I i typu II.F, Funkcja transferu synaptycznego w fryzurach typu II podczas wykreślania �cm przeciwko ICA przy potencjałach dodatnich od �10 do �20 mV (z komórek tesamowych pokazanych w E): Dane wyposażono w funkcję mocy z N � 0,90 � 0,16 (G �0,45�0,28 FF/PA;C, Funkcja transferu synaptycznego Itpe I Hair komórki podczas zmiany [Ca 2�] Ext.ICA i odpowiadające odpowiedzi � cm uzyskano z pojedynczego stopnia napięcia 500 ms od �80 do �10 mV w różnych zewnątrzkomórkowych CA 2� CON-centracje: 0, 1,3, 5, 10 i 20 mm w komórkach włosów OTOF/� (Kręgi wypełnione czerwonymi) i 0, 1,3, 5 i 10 mm w komórkach włosów typu dzikiego (czarne otwarte kółka).Każde wartości � cm i ICA są średnimi od 5 do 22 HAIR.Linie ciągłe pasują do punktów danych zgodnie z funkcją mocy z N � 0,97 � 0,05 (G � 0,95 � 0,20 ff/PA) i N � 3,38 � 0,06 (G � 2,80 10 �6 � 0,70 10 �6 FF/PA)odpowiednio komórek włosów typu I inwild i OTOF/�.

10482 • J. Neurosci., 26 sierpnia 2009 r. • 29 (34): 10474–10487 Dulon i in.• Otoferlin i egzocytoza w komórkach włosów przedsionkowych

Między �10 a �20 mV, tj. Przy stałym maksymalnym prawdopodobieństwie otwartymkannelu, ale zmniejszającym strumieniu Ca 2� na kanał, funkcja tetransferowa między �cm i ICA wykazała liniowe stopnie rozpętania, które zostało przybliżone przy użyciu funkcji energii z N �0,90 � �0,16, co nie różniło się znacząco od dzikiej maszyny do maszynki n � 0,80 � 0,24 (ryc. 7F).

Wyniki te pokazują, że w przypadku małych depolaryzacji egzocytoza w komórkach włosów OTOF�/� typu I i typu II nie może być przybliżona, prosta funkcja przenoszenia liniowego z sumowanego wejścia Ca 2�.W tebsencji Otoferlin egzocytoza jest znacznie mniej wydajna i funkcja w sposób kooperacyjny.

Wrażliwość egzocytozy na wewnętrzne buforowanie CA2�.Porównawcza zdolność wewnątrzkomórkowej bapty i EGTA do blokowania zdarzeń wyzwalanych Ca 2� jest również sposobem na zajęcie się organizacją przestrzenną kanałów CA 2� i czujnika CA 2� (Augustine i in., 2003). Dwa bufory Buforymają podobne powinowactwo równowagi do Ca 2�, ale Butbapta wykazuje 10 razy szybszą szybkość dla niż Thisegta wiążącego Ca 2�.Dlatego oczekuje się, że BAPTA zablokuje działanie CA 2� z nanodominami, podczas gdy EGTA ograniczałby tylko wewnątrzkomórkowe rozprzestrzenianie się w mikrodomentach.Egzocytoza skuteczności BAPTA/EGTA TOBLOCK, sugerowałaby przede wszystkim rozproszone sygnały Ca 2�, a Kaleks Hold Synaps (Augustine i in., 2003).W komórkach włosów typu I typu dzikiego stwierdziliśmy, że egzocytoza podczas depolaryzacji 500 mspulse z potencjału utrzymywania �80 do �10 mvwas całkowicie zablokowana przez 5 mM bapta (n � 4), ale nie miała wpływu na 5 mM EGTA (N � 5)(Ryc. 6b).Ponadto, testowane w warunkach podobnych, 5 mM EGTA nie blokowało odpowiedzi egzocytozy w

Komórki włosów typu dzikiego i OTOF�/� (N � 2; danych nie pokazano).Wyniki są najbardziej podobne, że kanały Ca 2� są zlokalizowane w odległości wielkości nanometru od miejsc ponownego wynajmu w komórkach włosów przedsionkowych.

Przechodnie komórki włosów OTOF�/� mikedysplay Morfologicznie normalne wstążki Zbadamy, czy Otoferlin jest produkowane przez dwa rodzaje fryzury przedsionkowej i czy istnieją wady synaptyczne w komórkach włosów, które pozbawione otherlinu, które mogłyby wyjaśnić wyżej wymienioną nieprawidłową egzocytozę egzocytozę tesekwetki.Badanie podwójnego immunolabelowania, usoferlin i �-tubulinowe przeciwciała tolabel tolabel komórek włosów i ich nerwy aferentne odpowiednio wykazało podobny rozkład OT-tyrlin w komórkach typu I i typu II i IIHAIR z myszy p7 myszy (ryc. 8A-C), Saccule i kanały półkoliste (danych nie pokazano).W szczególności, Otoferlin był w całej cytoplazmie od płytki skórkowej do podstawowego reguł synapticregionu, jak opisano w przypadku komórek włosów ślimakowych (Roux i in., 2006).Podobne dystrybucje zostały zgłoszone w ślimakowych komórkach włosów na białkach Snare Snap25 i Syn-Taxin1 (Safieddine i Whehhold, 1999). Te ustalenia są zgodne z tym, w zależności od części wierzchołkowej komórek włosów, obejmuje również inwesicle rezonansowanie wstążki synapsyjnej długiej stymulacji.(Griesinger etal., 2005).

Mikroskopia elektronowa z podłoża po postemoldach wykazała, że podobnie jak w ślimakowych komórkach włosów (Roux i in., 2006), Otoferlin Iloked w synaptycznej strefie aktywnej komórek włosów przedsionkowych, w tym pęcherzyków synaptycznych i presynaptycznej błony plazmatycznej (ryc. 8e).W trzech strefach aktywnych zawierających wstęgę analizowanych w komórkach włosów typu z myszy p6 stwierdziliśmy, że złote parti-CLE były głównie związane z presynaptycznym memem plazmatycznym i pęcherzykami przymocowanymi do wstążki.Cząsteczki złota były obserwowane w strefach pozasynaptycznych na endoplazmatycznym lumie reticu i urządzeniu Golgiego komórek włosów (danych nie pokazano).

Następnie przeprowadziliśmy analizę porównawczą ultrastruktury pasakowej do SYN za pomocą mikroskopii elektronowej w komórkach włosów przedsionkowych myszy typu dzikiego i zmutowanych.W obu genotypach stwierdziliśmy, że komórki włosów typu I i typu II mają typowe synapsy wstążki z wyraźną gęstością postsynaptyczną i pogrubienie presynaptyczne, które oznaczono wstążką ozdobioną pęcherzykami synaptycznymi (ryc. 9) (uzupełniająca ryc. S1, dostępna na stronie www.jneurosci.org jako materiał elastyczny).Ocena ilościowa wielkości strefy aktywnej nie wykazuje żadnej różnicy między z niedoborem OTOFERLIL-z niedoborem synapsów przedsionkowych a ich kontroli typu dzikiego typu Littermate (197 � 10nm, N � 25 vs 206 � 12 nm, N � 31; p � 0,05).Liczba punktów powiązanych z wstążką zakotwiczoną w strefie aktywnej synaptycznej również nie różniła się istotnie (odpowiednio 12 � 0,7 i 15 � 1,0 1,0 i kontrola; p � 0,05).Dwa do trzech punktów były średnio zadokowane na błonie presynapticplasma poniżej wstążki, zarówno w synapsach typu dzikiego, jak i mutanta.

Rycina 8. Ekspresja otoferlin w myszy Utricle.A-C, konfokalna mikroskopia fluorescencyjna mysie myszy p7 mysie utricle dublowane dla Otoferlin (A) i �-tubuliny III (B).Tubulina podaje kaleks nerwowy otaczające komórki włosów typu I.Połączony obraz w CSHOWS OTOFERLIN znakowanie w komórce włosów typu I (otoczona przez kalaks) i komórkach włosów typu II (brak otaczającego kalesa).D, Mikroskopia transmisja -elektronowa pokazująca dwa rodzaje komórek włosów w dorosłym myszy Utricle.E, Postematingowy immunogold elektronmikroskopia sekcji wykonanej w komórce włosów typu I z mysiego Utricle P6 przy użyciu przeciwciała anty-Otoferlinowego.Kilka cząstek złota wokół wstążki (groty strzałki) skierowaną w stronę kalaksatu neuronu aferentnego.Wstawka w prawym górnym rogu pokazuje kolejny przykład otoferlinlabeling, w którym kilka cząstek złota jest powiązanych z pęcherzykami wstążkowymi i przymocowane do błony presynaptycznej.

Dulon i in.• Otoferlin i egzocytoza w komórkach włosów przedsionkowych J. Neurosci., 26 sierpnia 2009 r. • 29 (34): 10474 –10487 • 10483

Eksperyment podwójnego barwienia z użyciem stawów z CTBP2 i GluR2/3 tolabel, odpowiednio wstążką i terminem postsynaptycznym (Roux i in., 2006), wykazał podobną ekspresję GLUR2/3 inotof�/� i typu dzikiego (suple-mentalfig..Ponadto podwójne barwienie przy użyciu przeciwciała Myozyny VIIA i CTBP2 do oznaczenia komórek włosów i wstążki, ponownie, nie wykazywało żadnej znaczącej ceny w liczbie wstążków ogniwa perhair między mutantami i komórkami typu dzikiego z centralnego obszaruThe Uutricle, niezależnie od typu komórki (9 �0,8, N � 63 vs 7 � 1,7, N � 56, odpowiednio; p � 0,05) (uzupełniająca ryc. S3, dostępna na www.jneurosci.org jako materiał SUP-umieszczony.).

Razem wyniki te sugerują, że tworzenie się synaptyczne i montaż przemieszczają się w komórkach włosów przedsionkowym myszy OTOF�/�, jak opisano dla komórek ślimakowych (Roux i in., 2006).Dalej, nasza obserwacja, że liczby pęcherzyków przywiązanych do wstążki i przechodzących na presynaptyczne mem-brane z plazmatycznego nie różnią się między myszy typu dzikiego i wskazują, że ani biogeneza, ani procesy dokowania pęcherzyków synaptycznych są naruszone w mutantach.Jest to zgodne z wstępnie wiarygodnym raportem z udziałem Otoferlin w kroku od etapu dokowania pęcherzyków synchronicznych do błony plazmatycznej (Roux i in., 2006).

DyskusjaPo pierwsze, normalne spontaniczne uwalnianie pęcherzyków ma miejsce w synapsie fryzury pozbawionej otoferlina, co jest zgodne z normalnymi synapsami Mor-fontologicznie obserwowanymi u tych myszy.Po drugie, Otoferlin nie jest niezbędny dla powiązanych komórek włosów synaptyczne odkształcenie lub fuzja.Ponadto zaobserwowano resztkowe wywołane rozdziały przedsionkowe i egzocytozę zależną od CA 2�, inotof�/� komórki włosów, co wskazuje, że jeśli Otoferlin jest czujnikiem Ca 2�, inny występuje w tych zmutowanych komórkach włosów.Konfiguracja Sucha została już zgłoszona w synapsach neuronalnych i komórkach chromafinowych nadnerczy, w których różne czujniki Ca 2� MaycoExist (Xu i in., 2007; Schonn i in., 2008).Ponieważ dojrzałe fryzury, w przeciwieństwie do neuronów, nie strzelają spontanicznego potencjału czynnościowego, spontaniczne uwalnianie nadajnika może obejmować kanały Ca 2� aktywowane o niskim napięciu, takie jak kanały typu t Cav3.1 (Nie i itpal., 2008), które można łatwo aktywować w pobliżu spoczynku.błoniny.Mechanizmy niezależne od Otoferlina niezależne odniesienie, które napędzają spontaniczną aktywność w komórkach włosów przedsionkowym, są wyjaśnione.

Komórki włosów typu I wykazują egzocytozę z szybszą kinetyką i wyższą czułość Ca 2� niż komórki włosów typu II dalej badają przyczynę wadliwej transferu VSEP u myszy OTOF�/�Zależna egzocytoza w MAM-Malian Hair Hair komórki włosów.Po raz pierwszy ustaliliśmy, że fryzury typu I u myszy typu dzikiego wykazują fazę Exocytozę Afast (RRP) i powolną (SRP) Exocytozę przypominającą te opisane w komórkach włosów ślimakowych ssaków (Moserand Beutner 2000; Johnson i in., 2005; Beurg i in., 2008) i komórki do włosów na niskim poziomie (Parsons i in., 1994; Edmonds i in., 2004; Schnee i in., 2005).Stwierdziliśmy, że egzocytoza RRP komórek włosów typu I wykazywała kinetykę aktywacji (� � 34 ms) CompA z egzemplarzem komórek włosów ślimakowych (� 53 ms), ale niższe zwolnienie 110 w porównaniu z 459 ff/s (Johnson i in., 2005).Jednak wskaźniki leczenia stają się podobne, gdy znormalizowane jest do liczby wstążek synaptycznych, które wynosi około dwóch do czterech meshigherów w ślimakowych wewnętrznych komórkach włosów niż w komórkach włosów przedsionkowych (Roux i in., 2006; Johnson i in., 2008).Razem nasze wyniki wskazują, że zależna od Ca 2� egzocytoza komórek włosów typu I łączy podobne właściwości z dojrzałymi komórkami włosów ślimakowych w warunkach kinetyki, wrażliwości Ca 2� i liniowej Ca 2�

zależność.

Rycina 9. Ultrastruktura synaptyczna jest normalna w komórkach włosów OTOF�/� typu I.A, C, Mikrografia elektronowa o niskiej mocy komórek włosów typu I z OTOF�/� (A) i OTOF�/� (C) UTRICLES P6.Komórki włosów typu I są identyfikowane przez otaczający ich Kalek z neuronu aferentnego.B, D, Mikrografie o wyższej magnizacji obszaru zawierającego wstęgę z OTOF�/� (B) i OTOF�/� (D) Komórki włosów typu I.Wstążki (R) stoją w obliczu konstrukcji postsynaptycznej zawierającej mitochondria, zakończeniem aferentnym z Calyx (A).Pęcherzyki są widoczne, które otaczają wstążkę zarówno w komórkach typu dzikiego, jak i zmutowanych.

10484 • J. Neurosci., 26 sierpnia 2009 r. • 29 (34): 10474–10487 Dulon i in.• Otoferlin i egzocytoza w komórkach włosów przedsionkowych

Egzocytoza w komórkach włosów typu II wykazywała wolniejszą kinetykę i zredukowała wydajność Ca 2� w porównaniu z komórkami włosów typu I.Różnice w egzocytozie stwierdzono również w fotoreceptorach siatkówki, z stożkami wykazującymi 10-krotną szybszą kinetykę niż pręty (Rabl i in., 2005), ale także między niedojrzałych i dojrzałych współwrzewnych komórek włosów (Johnson i in..Sam czujnik CA 2� (Thoreson, 2007).Implikacja kilku mechanizmów wykrywających Ca 2�, których kumbinacja może określić różną kinetykę komórek włosów przedsionkowych typu i typu II, jak opisano w kielichu wroczystości i w komórkach chromafinowych nadnerczy (Sun i in., 2007; Schonnet AL., 2008), należy brać pod uwagę w przyszłych badaniach.

Rola otoferlina w liniowej zależności Ca 2� Exocytozy w komórkach włosów przedsionkowym stwierdzono, że egzocytoza w komórkach włosów przedsionkowych typu dzikiego rozłącza się niezwykłą zależność Ca 2� podczas zmiany Ca 2�

Wejście, zmieniając pozakomórkowe stężenie Ca 2�, jednocześnie przechodząc do różnych potencjałów testowych lub depolaryzując komórki w różnych czasach.Podobny liniowy związek między exo-cytozą a wejściem Ca 2� uzyskano w dojrzałych komórkach włosów ślimaków (Moser i Beutner, 2000; Johnson i in., 2005,2008; Beurg i in., 2008) oraz w komórkach włosów z komórek włosów z komórek włosów z komórek włosów z komórek włosów z komórek włosów z komórek włosów zTurtle Auditorypapilla (Schnee i in., 2005).

Eksperymenty z fotolizą błysku wewnątrzkomórkowego w klatce Ca 2�, które bezpośrednio badają wewnętrzne powinowactwo czujnika Ca 2� (niezależnie od kanałów CA 2�), wykazały, że egzocytoza komórek włosów ślimakowych wykazuje piąte rzędu Ca 2�kooperatywność w niskim zakresie mikromolarnym stężeń Ca 2� i comesa prawie liniowych powyżej 10 �M (Beutner i in., 2001).Jak można to zrobić, że czujnik CA 2� ma wewnętrzną współpracę Ca 2�

Zależność, podczas gdy egzocytoza przekłada się na relację liniową z wejściem Ca 2� podczas depolaryzacji?Najbardziej prawdopodobnym wyjaśnieniem jest to, że podczas aktywacji napięcia kanałów Ca 2�, Ca 2�

Stężenie w miejscach uwalniania natychmiast nasyca czujnik 2�.Zastosowanie aktywowanych przez Ca 2� kanałów K� rzeczywiście wskazało, że stężenie Ca 2� natychmiast wzrasta jako kilkaset mikromolarnych w aktywnej strefie żaby szczebla włosów podczas depolaryzacji (Roberts i in., 1990).Niecochlearowe wewnętrzne komórki włosów, zależność Ca 2� Exocytoza Ulanie ortransmittera, okazało się liniowe, gdy zmieniają się liczba otwartych kanałów Ca 2� i są wysoce współpracujące, gdy zmieniają prąd jednokanałowy (Brandt i in., 2005; Goutman i podnośnik i podnośGlowatzki, 2007).To zachowanie jest kompatybilne z organizacją niezależnych (nieverlappapping) ca 2�

Nanodomain, w których aktywność jednego lub kilku kanałów Ca 2� jest wystarczająca do aktywacji uwalniania pobliskiego pęcherzyka (Zucker istockbridge, 1983; Zucker i Fogelson, 1986; Augustine, 1990). W kontrastu stwierdziliśmy tutaj, że egzocytozę w typu wsiadowymI Andtype II Komórki włosów są liniowo związane z skumulowanym wejściem Ca 2�, niezależnie od odpowiedniego wkładu kanału Ca 2� OpenProbability i strumienia Ca 2� na kanał, co sugeruje organizację podobną do amicrodoMain (Engisch i Nowycky, 1996; Mansvelder; Mansvelder;i zestawy, 2000).Jednak wysoka skuteczność bapta na EGTA w celu blokowania egzocytozy w komórkach włosów przedsionkowych dla odległości wielkości nanometru między kanałami Sen-Sen a kanałami CA 2�.Ponadto strefa aktywna komórek włosów przedsionowych ma „wewnętrzną wielkość nanometryczną” o średnicy 200 nm, która może zawierać aż 60 kanałów Ca 2� (nasze oszacowanie).W złotych rybkach lub żabach wakrzębowych komórkach włosów, zamrażanie-

Obserwacje pęknięcia elektron-mikroskopii synaptycznej strefy aktywnej wykazały obecność uporządkowanych równoległych układów parti-CLE (Hama, 1980; Roberts i in., 1990; Roberts, 1994).Zasugerowano, że tereny cząstek odzwierciedlają struktury organizacji, które wyrównują 90 kanałów Ca 2� poniżej wstążki i gdzie między rzędami cząstek są prawdopodobnie zlokalizowane, w granicach 50 nm, miejsca przymocowania pęcherzyków do uwalniania synaptycznego.Roberts (1994) zasugerował, że taka organizacja w tablicach zbliżyłaby kanały 2� blisko siebie i pozwolili na aktywność CA 2� z różnych kanałów na pokrycie się, aby osiągnąć stężenie mikromolarne w miejscach uwalniania.Nasze wyniki, co sugeruje skumulowany wpływ prądów wyrównawczych Ca 2� na egzocytozę, są kompatybilne z taką przestrzenną organizacją kanałów CA 2� i miejscem uwalniania w strefie tezynaptycznej komórek włosów przedsionkowych ssaków.

Zmutowane komórki włosów wykazały zmniejszoną egzocytozę z anonliniową zależnością Ca 2�, która prawdopodobnie jest związana z wewnętrzną operacją maszyny synaptycznej.W fryzurach OTOF�/� typu wczesna szybka faza egzocytozy była mniej wydajna i nieliniowo spokrewniona z Ca 2�, gdy zmienialiśmy liczbę kanałów Openca 2� podczas małych depolaryzacji, podczas gdy ponowna szanse stała się liniowa, gdy tylko zmienia się Ca Ca2� strumień na chan-nel przy maksymalnym prawdopodobieństwie otwartego kanału.„Histereza” w krzywej powiązanej z egzocytozą z napływem Ca 2� jest kompatybilna z przyczyną rekrutacją domen Ca 2� przy niewielkich depolaryzacyjnych przy braku Otoferlin.Wyniki sugerują, że otofer-lina, która może oddziaływać z kanałami CAV1.3 typu L Ca 2� i białkami SNARE (Roux i in., 2006; Ramakrishnan i in., 2009), działa jako czujnik Ca 2� o wysokim powinowactwie Ca 2�To pozwala na liniowość na poziomie Lowca 2�.Rozważa również możliwość, że kilka mechy-nisms wapnia leżący u podstaw synaptycznej egzocytozy komórek włosów przedsionkowych.Mechanizmy te mogą obejmować maszynerię wykrywającą Ahigh-Poważność Ca 2�, która obejmuje OTOFERLIN (QCA poniżej 5 szt.) I nieliniową nisko powinowactwo wapnia (QCA powyżej 5 szt.).Alternatywnie, OTOFERLIN nie może bethe końcowy czujnik, ale jest wymagany do tworzenia czułej, łatwo nasyconej maszyny synaptycznej CA 2�.

Znaczenie fizjologiczne liniowego transferu synaptycznego w synapsie pierwszej w szlaku przedsionkowym liniową zależność Ca 2� Uwalnianie nadajnika przy pierwszym apelacji SYN na szlaku przedsionkowym jest z pewnością niezbędne dla wydajnej i precyzyjnej transmisji, bez zniekształceń, małych sensoryzgencji do mózguObwód przedsionkowy odruchu oka. Interesujące jest to pierwsza centralna synaps układu przedsionkowego alsodisPulsPlapsuls offal liniowy związek między szybkością stymulacji aferentów przedsionkowych a synaptycznym chargetransferem w neuronach postsynaptycznego jądra przedsionkowego (Bagnall eal., 2008).Brak krótkoterminowej dynamiki, ułatwienia lub depresji, w tych centralnych synapsach wydaje się ważną liniowością cech.Nasze ustalenia sugerują, że niezwykła szarpana akterystyka układu przedsionkowego, jego czasowa precyzja, czułość i szeroki zakres dynamiczny, najpierw polegają na liniowej transmisji synapsy komórek włosów, a Otoferlin jest krytyczny dla egzocytosisto, osiągają wysoce czułe liniowe Ca Ca2� Zależność.

ReferencesAlmanza A, Vega R, Soto E (2003) Ca 2� prąd w komórkach włosów typu I izolowane

z półkolistego kanału Crista ampullaris szczura.Brain Res994: 175–180.

Augustine GJ (1990) Regulacja uwalniania nadajnika w giantsynapse kałamarnicy za pomocą presynaptycznego opóźnionego prądu potasowego prostownika.J Physiol431: 343–364.

Augustine GJ, Santamaria F, Tanaka K (2003) Lokalne inneurony sygnalizacyjne wapnia.Neuron 40: 331–346.

Dulon i in.• Otoferlin i egzocytoza w komórkach włosów przedsionkowych J. Neurosci., 26 sierpnia 2009 r. • 29 (34): 10474 –10487 • 10485

Bagnall MW, McElvain LE, Faulstich M, Du Lac S (2008) Niezależna od częstotliwości transmisja synaptyczna obsługuje liniowe zachowanie przedsionkowe. Neuron 60: 343–352.

Bao H, Wong WH, Goldberg JM, Eatock RA (2003) Bramowane napięcie prąd wapnia w komórkach włosów typu I i typu II izolowane z szczura Crista.J Neoprofiziolu 90: 155–164.

Beurg M, Safieddine S, Roux I, Bouleau Y, Petit C, Dulon D (2008) Exocytoza zależna od wapnia i otoferlina przez niedojrzałe fryzury zewnętrzne.J Neurosci 28: 1798–1803.

Beutner D, Voets T, Neher E, Moser T (2001) Zależność wapnia Exo-cytozy i endocytozy w synapsie aferentnej komórek włosów ślimakowych. Neuron 29: 681–690.

Brandt A, Khimich D, Moser T (2005) Niewiele kanałów CAV1.3 reguluje podekscytozę pęcherzyka synaptycznego w synapsie wstążki komórkowej.J Neurosci25: 11577–11585.

Dou H, Vazquez AE, Namkung Y, Chhu H, Cardell EL, Nie L, Parson S, Shinhs, Yamah EN (2004) Mutacja zerowa 1d Ca 2 Kanałowy wynik nie ma głuchotości przedsionkowej u myszy.J Assoc Res Otolararyngol5: 215–2

Eatock RA, Xue J, Kalluri R (2008) Kanały jonowe w ssakach przedsionkowych mogą powodować regularność strzelania.J Exp Biol 211: 1764–1774.

Edmonds BW, Gregory FD, Schweizer FE (2004) Dowód, że szybka exocytoza może być głównie pośredniczna przez pęcherzyki, które nie są zadokowane w strefach aktywnych w komórkach włosów sakierowych żab.J Physiol 560: 439 - 450.

Engisch KL, Nelycky MC (1996) Zależność wapnia o dużej egzocytozie gęstej krosy o powierzchni gęstości wywołanej przez napływ wapnia w bydlęcego nadnerczy chromaffindeli.J Neurosci 16: 1359–1369.

GLOWATZKI E, FUCHS PA (2002) Uwolnienie nadajnika przy wstążku do komórek włosów.NAT Neurosci 5: 147–154.

Goldberg JM (1991) Organy końcowe przedsionkowe: różnorodność morfologiczna i fizjologiczna aferentów.CURR Opin Neurobiol 1: 229–235.

Goldberg JM (1996) Analiza teoretyczna komunikacji międzykomórkowej między komórką włosów typu I typu I i jej zakończeniem.J NeuroPhysiol76: 1942–1957.

Goldberg JM, Fernandez C (1971) Fizjologia neuronów peryferyjnych wewnętrznych kanałów półkolisowych małpy wiewiórki.I. spoczynkowe wyładowanie i odpowiedź na stałe przyspieszenia kątowe.J Neurofiziolu 34: 635–660.

Goutman JD, Glowatzki E (2007) Przebieg czasowy i zależność od wapnia uwalniania transmittera przy pojedynczej synapsie wstążki.Proc Natl Acad Sci U S A104: 16341–16346.

Grant L, Fuchs P (2008) Inaktywacja zależna od wapnia i kalmoduliny kanałów wapniowych w wewnętrznych komórkach włosów ślimaka szczura.J NeuroPhysiol99: 2183–2193.

Griesinger CB, Richards CD, Ashmore JF (2005) Szybkie pęcherzyki uzupełniające Sygnalizację niestrudzoną przy pierwszej synapsie słuchowej.Nature435: 212–215.

Hama K (1980) Drobna struktura synapsy aferentnej i połączeń szczeliny na komórce włosów sensorycznych w sakowanej plamce złotej rybki: liofiliza-kłut.J neurocytol 9: 845–860.

Hullar TE, Minor LB (1999) Dynamika wysokiej częstotliwości regularnie obciążających aferentów kanałowych zapewnia liniowy sygnał do kątowego kątowego przedsionka.J neurofizol 82: 2000–2005.

Huterer M, Cullen Ke (2002) Dynamika odruchu przedsionkowego podczas obrotów o wysokiej częstotliwości i wysokiej częstotliwości głowy na ciele w Rhesusmonkey.J neurofizol 88: 13–28.

Johnson SL, Thomas MV, Kros CJ (2002) Miernik pojemności membranowej za pomocą klamry łatek ze zintegrowanym wzmacniaczem równoważenia blokady.

Johnson SL, Marcotti W, Kros CJ (2005) Wzrost wydajności i redukcji w zależności od egzocytozy Ca 2� podczas rozwoju komórek włosów myszy.J Physiol 563: 177–191.

Johnson SL, Forge A, Knipper M, Munkner S, Marcotti W (2008) Tono-topic zmienność zależności wapnia neurotransmittera odlanego i uzupełniania puli pęcherzyków w ssakowych synapsach wstążki słuchowej. J Neurosci 28: 7670–7678.

Jones SM, Erway LC, Bergstrom RA, Schimenti JC, Jones TA (1999) Odpowiedzi płorowe na liniowe przyspieszenie są nieobecne u myszy Otoconia-deficentc57Bl/6Jei-Het.Posłuchaj Res 135: 56–60.

Jones SM, Jones TA, Johnson KR, Yu H, Erway LC, Zheng QY (2006) Acumparison fenotypów przedsionkowych i słuchowych w mousestrainach wsobnych.Brain Res 1091: 40 - 46.

Keen EC, Hudspeth AJ (2006) Charakterystyka przenoszenia synapsy komórek włosów.Proc Natl Acad sci u s a 103: 5537–5542.

Khimich D, Nouvian R, Pujol R, Tom Dieck S, Egner A, Gundelfinger ED, Moser T (2005) Wstążki synaptyczne komórek włosów są niezbędne do sygnalizacji synchronicznej.Nature 434: 889 - 894.

Zestawy KS, de Vlieger TA, Kooi BW, Mansvelder HD (1999) Dyfuzyjne bariery wpływowe mobilne bufory wapnia na egzocytozę dużych gęstej pęcherzyki.Biophys J 76: 1693–1705.

Lee Hy, Camp AJ, Callister RJ, Brichta AM (2005) Przechodnie pierwotne działanie aft-ie w przygotowaniu ucha wewnętrznego myszy in vitro.J Neuroscimetods 145: 73–87.

Lenzi D, Ruryeon JW, Crum J, Ellisman MH, Roberts WM (1999) Populacje synaptycvesicle w wakularnych komórkach włosów zrekonstruowanych przez rafię elektronową.J Neurosci 19: 119–132.

Longo-guess C, Gagnon LH, Bergstrom DE, Johnson KR (2007) Missensemutation w konserwowanej domenie OTOFERLIN C2B powoduje głuchotliwość w nowo mysim modelu DFNB9.Posłuchaj Res 234: 21–28.

Mansvelder HD, Zestawy KS (2000) Wszystkie klasy pary kanału wapniowego z wydajnością równoważą do egzocytozy w melanotrofach szczurów, indukując sprzężenie liniowe-segretację bodźca.J Physiol 526: 327–339.

Meyer AC, Frank T, Khimich D, Hoch G, Riedel D, Chapochnikov NM, Yarinym, Harke B, Hell SW, Egner A, Moser T (2009) Tuning synaps Num-ber, struktura i funkcja w ślimaku.NAT Neurosci 12: 444–453.

Moser T, Beutner D (2000) Kinetyka egzocytozy i endocytoisss w systernacji myszy myszy.Proc Natl Acad Sciu S A 97: 883–888.

Nazareth AM, Jones TA (1998) Peryferyjne i centralne elementy potencjałów wywołanych przedszkolakami.J Vestib Res 8: 233–252.

Nie L, Zhu J, Gratton MA, Liao A, Mu KJ, Nonner W, Richardson GP, Yamoah EN (2008) Tożsamość molekularna i właściwości funkcjonalne kanału Ca 2� typu Ttype typu T typu T typu T typu.J Neurofiziol 100: 2287–2299.

Nouvian R, Beutner D, Parsons TD, Moser T (2006) Struktura i funkcja synapsy wstążki komórkowej.J Membr Biol 209: 153–165.

Parsons TD, Lenzi D, Almers W, Roberts WM (1994) Wycofanie wapnia i endocytoza w izolowanej komórce presynaptycznej: kondensacje w komórkach włosów w wakularnym.Neuron 13: 875–883.

Rabl K, Cadetti L, Thoreson WB (2005) Kinetyka egzocytozy jest szybszym wskaźnikiem niż u prętów.J Neurosci 25: 4633–4640.

Ramakrishnan NA, Drescher MJ, Barretto RL, Beisel KW, Hatfield JS, Drescher DG (2009) Bezpośrednia interakcja Otferlin z składnią 1A, SNAP-25 i L CAV1.3 typu L CAV1.3.J Biol Chem284: 3227–3238.

Roberts WM (1994) Lokalizacja sygnałów wapnia przez mobilny buffer wapnia w żabach wakularnych komórkach włosów.J Neurosci 14: 3246–3262.

Roberts WM, Jacobs RA, Hudspeth AJ (1990) Kolokalizacja jonów chan-nels zaangażowanych w selektywność częstotliwości i transmisję synaptyczną w presyn-praptowych strefach aktywnych komórek włosów.J Neurosci 10: 3664–3684.

Roux I, Safieddine S, Nouvian R, Grati M, Simmler MC, Bahloul A, Perfettini I, Le Gall M, Rostaing P, Hamard G, Triller A, Avan P, Moser T, Petit C (2006) Otoferlin, wadliwy wForma głuchoty ludzkiej jest niezbędna forexocytoza w synapsie wstążki słuchowej.Komórka 127: 277–289.

Rusch A, Lysakowski A, Eatock RA (1998) Rozwój poporodowy komórek włosów typu IIAN typu II w mysim Utricle: pozyskiwanie przedwodnictw i zróżnicowanej morfologii i zróżnicowanej morfologii.J Neurosci 18: 7487–7501.

Safeddine S, Willhold RJ (1999) SNARE Complex w synapsach wstążkowych komórek włosów z płaszczyzny: analiza białek związanych z pęcherzykami synaptycznymi i synaptyczną.EUR J Neurosci 11: 803–812.

Schnee ME, Lawton DM, Furness DN, Benke TA, Ricci AJ (2005) Synapsy włókien ogniwowo-komórkowych z komórkami słuchowymi są specjalizowane do działalności przy ich najlepszych przypadkach.Neuron 47: 243–254.

Schon JS, Maximov A, Lao Y, Sudhof TC, Sørensen JB (2008) Synaptogmin-1 i -7 są nakładającymi się czujnikami CA 2 za nakładanie się funduszy w komórkach Chroffina nadnerczy.Proc Natl Acad Scientist S A 105: 3998–4

Schug N, Braig C, Zimmermann U, Engel J, Winter H, Ruth P, Blin N, Pfisterm, Kalbacher H, Kniper M (2006) Różnicowa ekspresja mózgu otoferlininy, układ przedsionkowy, niedojrzały i dojrzały kochea szczura.EURJ Neurosci 24: 3372–3380.

Schwander M, Sczanicka A, Grillet N, Bailey JS, Avenarius M, Najmabadi H, Steffy BM, Federe GC, Lagler EA, Banan R, Hice R, Grabowski-Boase L, Keithley EM, Ryan AF, Housley GD, Wiltshire T,Smith RJ, Tarantinolm, Muller U (2007) Przedawany ekran genetyki u myszy identyfikuje Reces-

10486 • J. Neurosci., 26 sierpnia 2009 r. • 29 (34): 10474–10487 Dulon i in.• Otoferlin i egzocytoza w komórkach włosów przedsionkowych

Cechy głuchoty i ujawniają, że pejvakin jest niezbędny do funkcji zewnętrznej komórki włosów.J Neurosci 27: 2163–2175.

Sun J, Pang ZP, Qin D, Fahim AT, Adachi R, Sudhof TC (2007) Model podwójnego czujnika 2� do uwalniania neuroprzekaźnika w środkowej synapsie. Nature 450: 676-682.

Thoreson WB (2007) Kinetyka transmisji synaptycznej w synapsach wstążkowych prętów i stożków.Mol Neurobiol 36: 205–223.

Xu J, Mashimo T, Sudhof TC (2007) Synaptotagmin -1, -2 i -9: Ca 2�

Czujniki do szybkiego uwalniania, które określają wyraźne właściwości presynaptyczne w podsumach neuronów.Neuron 54: 567–581.

UPP, wszystkie Syone, ale słyszy i temb, 206) 206) 20 mmmɔ 2 1 1 ¶1-2

NELS przez białka wiążące wapń słuchowych komórek włosów.J Neurosci26: 10677–10689.

Yasunaga S, Grati M, Cohen-Salmon M, El-Amraoui A, Mustapha M, Salemn, El-Zir E, Loiselet J, Petit C (1999) Mutacja w OTOF, Encodingotoferlin, białko przypominające Fer-1, przyczyny przyczynomDFNB9, niesyndromiczna forma pozdrawiania.Nat Genet 21: 363–369.

Zucker RS, Fogelson AL (1986) Zależność między odlanym nadajnikiem i presynaptyczne napływ wapnia, gdy wapń wchodzi przez dyskretechannele.Proc Natl Acad Sci u s A 83: 3032–3036.

Zucker RS, Stockbridge N (1983) Presynaptyczna dyfuzja wapnia i kursy zwolnienia nadajnika i ułatwianie synaptyczne w synapsie Squidgiant.J Neurosci 3: 1263–1269.

Dulon i in.• Otoferlin i egzocytoza w komórkach włosów przedsionkowych J. Neurosci., 26 sierpnia 2009 r. • 29 (34): 10474 –10487 • 10487